整理生化试验技术.docx

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整理生化试验技术

生物化学研究技术与方法；第一章第二章层析分离技术；一、名词解释；1.生化技术：

是在生物化学及其相关学科应用的各种；2.提取（萃取）：

是在一定的条件下，用一定的溶剂；3..沉淀分离技术：

是通过改变某些条件或加入某种；4.盐溶：

低盐浓度下蛋白质的溶解度随着盐浓度的升；5.盐析作用：

盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶；6.等电点沉淀法：

是利用蛋白质在pI时溶解度最小的原理。

生物化学研究技术与方法

第一章第二章层析分离技术

一、名词解释

1.生化技术：

是在生物化学及其相关学科应用的各种技术。

主要是指生物体内物质及其代谢产物，特别是生物大分子的分离、检测、制备与改造技术。

2.提取（萃取）：

是在一定的条件下，用一定的溶剂处理样品，使欲分离的物质充分释放到溶剂中的过程。

又称“抽提”或“萃取”。

3..沉淀分离技术：

是通过改变某些条件或加入某种物质，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出的技术。

4.盐溶：

低盐浓度下蛋白质的溶解度随着盐浓度的升高而增加的现象。

5.盐析作用：

盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象即为盐析作用。

6.等电点沉淀法：

是利用蛋白质在pI时溶解度最低，以及不同的蛋白质有不同的pI这一特性，对蛋白质进行分离纯化的方法。

7.有机溶剂沉淀法：

利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。

二、填空

1.现代生化技术的显著特点：

是以三高所著称，即：

高技术、高投入、及高利润。

2.生物大分子主要包括：

蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类，它们是生物体内存在的具有特殊生物学功能的高分子化合物。

3.生化分离技术主要有沉淀分离技术分离、层析分离技术分离、电泳分离技术分离和超离心分离技术分离技术。

4.蛋白质和酶的种类繁多，在提取时应根据其存在的部位、分子结构及溶解性质的不同选择不同的提取方法。

5.影响提取的因素主要有溶剂、溶解度、温度、pH和浓度差等。

6.水溶液法提取酶和蛋白质时，要注意控制好盐浓度、温度、pH值等因素。

7.沉淀分离技术包括盐析沉淀、等电点沉淀和有机溶剂沉淀等技术。

8.在分段盐析中，在一定的pH和温度条件下，改变离子强度称为Ks分段盐析，而在一定的盐和离子强度条件下，改变温度或pH值称为β分段盐析。

9.实验室进行蛋白质盐析沉淀时应用最多、最广的盐是硫酸铵。

10.在核蛋白提取时，应选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取核糖核蛋白，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白。

11.核酸分离时从pH5沉淀中可分离得到tRNA。

12.RNA的提取方法主要有稀盐溶液提取和苯酚水溶液提取。

13.苯酚水溶液提取核酸时，蛋白质和DNA沉淀于苯酚层中，而RNA和多糖溶解于水层中。

14.核酸沉淀分离主要有有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、钙盐沉淀法和选择性溶剂沉淀四种方法。

15.能够选择性地沉淀DNA的试剂是异丙醇。

三、问答题

1．进行细胞破碎的方法有哪些：

①机械破碎法：

是通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法。

②物理破碎法：

用各种物理因素（温度、压力、超声波）的作用使细胞破碎的方法。

③化学破碎法：

用化学试剂可使细胞膜结构改变或破坏，改变细胞膜的通透性。

④酶学破碎法：

通过加入酶或利用细胞本身的酶的作用，使细胞破碎的方法。

2．蛋白质和酶提取、分离的一般原则：

①提取、分离方法条件要温和使目的蛋白质和酶的活性和功能不受损害②尽量尽早除去各种杂质、脂类、核酸及毒素。

③设法除去变性的和不需要的蛋白质。

④设法提高目的蛋白质的含量或生物活性。

⑤分离纯化要在缓冲溶液中进行。

⑥建立灵敏、特异、精确的检测方法。

⑦根据其存在的部位、分子结构及溶解性质的不同选择不同的提取方法。

3．实验室进行蛋白质盐析沉淀时应用最多、最广的是硫酸铵，它的优缺点是什么：

优点：

①它在水中溶解度大；②其溶解度受温度的影响较小；③价廉易得；④不易引起蛋白质变性；⑤分离效果比其它盐好。

缺点：

①缓冲能力差；②NH4+离子会干扰蛋白氮的测定。

4．核酸提取要注意的原则：

①防止核酸酶的降解:

在提取分离核酸时要降低核酸酶的活性，通常加入抑制剂和去激活剂。

②防止化学因素的降解:

避免强酸强碱。

③防止物理因素的降解:

核酸大分子、高温、机械作用等均可以破坏核酸分子的完整性，因此核酸提取适于在低温及避免剧烈搅拌等条件下进行。

一、名词解释

1.层析分离技术：

是利用混合物中各组分的物理、化学性质（分子的形状和大小、分子的极性、吸附力、分子的亲和力、分子的分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。

2..吸附层析：

是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的技术。

3.解吸作用：

在一定条件下，被吸附物离开吸附剂表面的现象称为解吸作用

4.洗脱：

加入解吸附剂，使物质从固定相上分离下来的方法。

5.分配层析：

是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。

6.分配系数：

是一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。

7.薄层层析：

是将固定相的支持剂均匀地铺在支持板上，成为薄层，把样品点在薄层上，用适当的溶剂展开，从而使样品中各组分达到分离的一种层析技术。

8.气相层析：

是一种以气体为流动相的一种高效、快速的层析分离技术。

9.担体：

是固定相的“载体”或“固体支持物”，大多为多孔性固体颗粒。

10.死时间：

从进样到出现空气峰最高峰的时间。

11.保留时间：

从进样到出现色谱峰最高点所需的时间。

12.校正保留时间：

指样品组分的保留时间与进样到出现空气峰最高值的时间之差。

13.死体积：

指从进样到出现空气峰最高值时所通过的载气体积

14.保留体积：

指从进样到出现组分浓度最高峰时所通过的载气体积

15.校正保留体积：

指保留体积与死体积之差

16.定量校正因子：

是单位峰面积中某物质的量

17.离子交换层析：

是利用离子交换剂上可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到物质分离的一种层析分离技术

18.凝胶层析：

又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。

是用高交联度的固体凝胶按照物质分子量大小进行分离的技术。

19.洗脱体积：

某一组分物质从加样到层析最高峰出现时所需的洗脱液总体积。

20.亲和层析：

是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的技术。

21.配基：

又称为“配体”。

指亲和层析中作为固定相的一方。

二、填空

1.层析分离技术按流动相状态可分为液相层析和气相层析；按分离过程所主要依据的物理化学性质分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻（凝胶过滤）层析、亲和层析等。

2.洗脱方法根据所用洗脱剂不同分为溶剂洗脱法、臵换法（取代法）、前缘分析法（前缘洗脱法）。

3..聚酰胺薄膜层析只适用于极性分子的分离。

4.纸上层析是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂作为流动相，展开时样品中各物质在两相之间不断地进行分配，由于各物质有不同的分配系数、移动的速率也就不同，从而达到分离的目的。

5.溶质在滤纸上移动的速度可用Rf值表示，Rf=溶质斑点中心移动的距离／溶剂前沿移动的距离，Rf值决定于分配系数，不同的物质在两相间的分配系数不同，Rf值也不同，由此可根据Rf值的大小对物质进行定性分析。

6.薄层层析中用的薄层板有硬板（湿板）与软板（干板）之分，常用的薄层板制作方法有浸涂法、喷涂法、倾斜涂布法法和推铺法法。

7.气相层析根据其固定相的不同可分为气固层析和气液层析两种。

8.气相层析具有分辨率高、分析速度快、灵敏度高和应用范围广等特点。

9.气固层析的固定相为固体，其分离的主要依据是吸附剂对被吸附物的吸附力不同，所以又称为气相吸附层析；气液层析的固定相为液体，其分离的主要依据是分配系数的不同，又称为气相分配层析。

10.气相层析的流动相是气体，称为载气，常用的有氢气、氮气、氦气、氩气等。

载气的选择主要根据所使用的检测器和载体气流决定。

11.红色担体用于分离非极性和弱极性物质；白色担体用于分离极性物质

12.气相层析时，样品在进柱前必须变为气体，有些物质难于气化必须先将其转变为易挥发的衍生物再进行气相层析。

13.进行气相层析时，应注意控制好气体流量、进样温度、进样时间和进样量。

14.热导池检测器属于浓度型检测器。

氢焰检测器属于质量型检测器，其灵敏度比热导池检测器高１０００倍左右，是目前应用最广泛的检测器之一。

15.离子交换层析的操作过程包括上柱（加样）、洗脱和收集、树脂再生三大步骤。

16.凝胶装柱时必须注意柱中不能有气泡或裂纹存在

三、问答题：

1.选择吸附剂时应注意的问题：

①吸附剂应有适当的吸附力和尽量大的表面积；②对被分离物有足够的分辨率，对不同物质的吸附力不同；③对被吸附物的吸附应是可逆的，一定条件下可解吸、洗脱；④不溶于所用的溶剂中，不引起被吸附物化学变化；⑤颗粒均匀，操作时稳定，不会破裂。

2.选择洗脱剂时应注意的问题：

①不与吸附剂起化学反应，且不使吸附剂溶解；②对样品的各组分溶解度大、粘度小、流动性好；③不与各组分起化学反应，且易与被洗脱组分分开；④纯度高，无杂质影响。

3.纸层析时对滤纸的选择有何要求：

滤纸的厚薄程度、纤维的松紧度不同，使与滤纸纤维结合的水量不一样，两相的体积比也不同。

得到的Rf值也不相同。

滤纸中的杂质也会影响Rf值。

因此，层析时对滤纸的要求较高：

由高纯度的棉花制成，质地均一、厚薄一致、纤维松紧度适中、有一定的机械强度。

4.在纸层析前，滤纸和层析装臵为什么要先用层析溶剂平衡：

层析前滤纸与层析装臵用溶剂系统的蒸气饱和。

不平衡时滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组成发生改变，导致溶剂前沿不齐，影响层析效果和Rｆ值。

5.担体应具备哪些条件：

①表面积大；②孔径分布较均匀；③表面无催化或吸附性能；④与固定液或被分析的物质不起化学反应；⑤热稳定性好；⑥有较好的机械强度。

6.离子交换剂选择时应考虑哪些因素：

①样品离子带何种电荷阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阳离子只能被阳离子交换剂吸附；②离子的浓度浓度大时，选择交换容量大的交换剂型号③被分离物质相对分子量的大小分子量大时要求交联度低，分子量小时选择较高交联度更好；④离子与交换剂亲和力的大小选择不同型号的交换剂，既要考虑吸附，还要考虑便于洗脱；⑤样品物质及交换树脂的物理化学特性根据其对酸、碱、温度的敏感情况，控制好环境条件。

7.试述凝胶层析的基本原理：

⑴凝胶是一种多微孔的多孔径网状支持物组成进行分子过滤的分子筛；⑵物质分子在层析柱中的运动有重力的垂直方向运动和无定向扩散的布郎运动；⑶大分子物质不能进入微孔在凝胶空隙间快速流出层析柱；⑷小分子能够进入微孔，因而在凝胶中许多孔中穿行，因通过的距离长，后流出层析柱；⑸分子直径越小能够进入的孔越多，流出层析柱越慢；⑹根据分子筛这一原理可依据物质分子直径的大小按照由大到小的顺序流出层析柱而得到分离。

⑹因此，它是一个反筛。

第三章电泳技术

一、名词解释：

1.电泳：

是带电粒子在电场中向着与本身所带电荷相反的电极移动的现象。

2.泳动度：

泳动度（μ）——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度

3.薄层电泳：