食用菌菌种生产文档格式.docx

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1支30支（再生母种）

1支再生母种8瓶

1瓶20袋（瓶）

二、制种设备和条件

（一）机械设备

1、原料加工设备

枝材切片机、木片粉碎机

2、拌料分装设备

搅拌机、装瓶机or装袋机

（二）灭菌设备

1、灭菌设备

高压灭菌锅、常压灭菌灶

2、消毒条件

药剂、紫外灯、电子灭菌器等

（三）接种设备

1、接种条件

接种室——无菌室，4-8m2，缓冲间，紫外灯

2、接种设备

超净工作台or接种箱、接种工具、酒精灯

（四）培养设备

1、培养条件

菌种培养室

2、培养设备

恒温培养箱

（五）保藏设备

1、冰箱冷藏室

2、冷藏恒温库

标题三>

第三节食用菌菌种培养基

一、培养基

就是采用人工的方法，按照一定比例配制各种营养物质以供给食用菌生长繁殖的基质。

培养基必须具备三个条件：

第一：

含有该菌生长发育所需的营养物质。

第二：

具有一定的生长环境。

第三：

必须经过严格的灭菌，保持无菌状态。

（一）物理状态

1、液体培养基：

是指把食用菌生长发育所需的营养物质按一定比例加水配制而成的液体培养基。

营养成分分布均匀，有利于食用菌充分接触和吸收养料，因而菌丝体生长迅速而粗壮，同时这种液体菌种便于接种工作的机械化、自动化，有利于提高生产效率。

缺点：

是要发酵设备，成本较高，也较复杂。

液体培养基常用来观察菌种的培养特征以及检查菌种的污染情况。

用途：

实验室，用于生理生化方面的研究；

生产上，用于培养液体菌种或生产菌丝体及其代谢产物。

2、固体培养基：

是以含有纤维素、木质素、淀粉等各种碳源物质为主，添加适量有机氮源、无机盐等，含有一定水分呈现固体状态的培养基。

优点：

原料来源广泛，价格低廉，配制容易，营养丰富。

菌丝体生长较慢。

是食用菌原种和栽培种的主要培养基。

3、固化培养基：

是指将各种营养物质按比例配制成营养液后，再加入适量的凝固剂，如2%左右的琼脂，加热至60℃以上是液体，冷却到40℃以下时则为固体。

主要用于母种的分离和保藏。

（二）营养来源

（1）天然培养基（利用天然来源的有机物配制而成。

）

（2）合成培养基（由各种纯化学物质按一定比例配制而成。

（3）半合成培养基（由部分纯化学物质和部分天然物质配制而成。

（三）表面形式

（1）斜面培养基

（2）平面培养基

（3）高层培养基

（四）用途

（1）母种培养基

（2）原种培养基

（3）栽培种培养基

二、母种常用培养基

（一）母种培养基常用物质

马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、维生素B1等。

马铃薯

葡萄糖

磷酸二氢钾

硫酸镁

琼脂

（二）常见的母种培养基

1、马铃薯葡萄糖培养基（PDA培养基）：

马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18-20g、水1000ml。

2、马铃薯综合培养基：

马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂18-20g、维生素B110mg、水1000ml。

3、木屑浸出汁培养基

4、棉籽壳煮汁培养基

5、豆芽汁培养基等等

（三）母种斜面培养基的制作

1、称取

用天平称取培养基各种成分的用量。

2、配制溶液

为避免发生沉淀，加入的顺序一般是先加缓冲化合物，溶解后加入主要元素，然后是微量元素，再加入维生素等。

最好是每种成分溶解后，再加入第二种营养成分。

若各种成分均不发生沉淀，也可以一起加入。

若用马铃薯、玉米粉、苹果、米粉、木屑等原料时，应先制取这些原料的煮汁，然后再把煮汁与其它成分混合。

例如：

PDA培养基的配制

把选好的马铃薯洗净，去皮挖去芽眼，切成薄片或1厘米大小的方块，称取200克放在容器中，加水1000毫升，加热煮沸20～30分钟，至软而不烂的程度，用四层纱布过滤；

取其滤液。

在滤液中加入琼脂，小火加热，用玻璃棒不断搅拌，以防溢出或焦底，至琼脂全部溶化，再加入葡萄糖使其溶化，最后加水至1000毫升即成。

3、调pH

一般用10％HCl或10％NaOH调pH，用pH试纸（或pH计）进行测试。

4、分装

培养基配制好后，趁热倒入大的玻璃漏斗中，打开弹簧夹，按需要分装于试管或三角瓶内。

注意事项：

（1）将漏斗导管插入试管中下部，以防培养基沾在管口或瓶口。

（2）分装体积：

以试管总长的1/4～1/5为宜，三角瓶容量1/3为宜。

5、塞棉塞

这样既可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。

制棉塞的方法多种，形状各异，总原则如下：

（1）用普通棉花制作。

（2）松紧适合。

（3）塞头不要太大，一般为球状。

（1）制作斜面培养基。

一般斜面长度达试管长度的1/2～2/3为宜，待冷却后即成斜面培养基。

（2）制作平板培养基。

灭菌的三角瓶中的培养基，倒入无菌培养皿中（每皿倒入15～20毫升），凝固后即成平板培养基。

8、无菌检查

取数支斜面培养基放人28℃左右的恒温箱中培养2～3天，若无杂菌生长便可使用。

若暂时用不完，用纸包好放人4℃冰箱保存。

6、灭菌

将包扎好的试管直立放人手提高压灭菌锅内，盖上牛皮纸，在1.05kg/cm2压力下，灭菌30分钟。

7、摆斜面

灭菌后冷却到60℃左右，从锅内取出，趁热摆成斜面。

三、原种和栽培种常用的培养基

（一）常用的培养基P42

1、棉籽壳培养基

棉籽壳98%、蔗糖1%、石膏粉1%、加水调至65%左右。

2、木屑培养基

木屑78%、米糠或麸皮20%、蔗糖1%、石膏粉1%、加水调至50%～60%左右。

3、棉籽壳麦麸培养基

4、棉籽壳木屑培养基

（二）培养基的制作

1、称料先称主料，再称辅料

2、拌料

4、分装培养料

5、清洁瓶、袋外壁。

6、封口

7、灭菌

标题四>

第四节食用菌菌种分离

一、菌种分离方法

组织分离法（最常用的方法）

孢子分离法（不常用的方法）

基质分离法（没办法的办法）

（一）组织分离法

1、概念

将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。

部分组织：

子实体或菌核、菌索的任何一部分组织

2、特点：

属于无性繁殖，能保持原有菌株的优良种性。

方法简单易行，适用于所有伞菌及猴头菌。

若种菇感染病毒，不易脱毒。

（1）子实体组织分离法：

他是采用子实体的任何一部分如菌盖、菌柄、菌褶、菌肉进行组织培养，而形成菌丝体的方法。

尽管子实体的任何一部分都能分离培养出菌种，但是多年的实践经验表明，选用菌柄和菌褶交接处的菌肉最好。

子实体组织分离的方法和步骤：

种菇的选择-→种菇的消毒-→切块接种-→培养纯化-→出菇试验→母种

操作过程（以伞菌类为例）：

种菇选择：

选择头潮菇、外观典型、大小适中、菌肉肥厚、颜色正常、尚未散孢、无病虫害、长至七八分成熟的优质单朵菇作种菇。

种菇消毒：

0.1%升汞溶液或75%酒精，浸泡或擦拭，无菌水冲洗，吸干表面的水分。

切块接种：

将分离种菇沿柄中心纵向掰成两半，用解剖刀在菇盖柄交接处划成田字形，取黄豆大一小块菌肉组织，接在斜面培养基上。

培养纯化：

在25℃下，培养2～4d长出白色绒毛状菌丝体，当菌丝延伸到基质上后，用接种针挑取菌丝顶端部分，接种到新的斜面培养基上，长满管后即为母种。

（2）菌核组织分离法：

它是从食用菌菌核分离培养获得纯菌丝的一种方法。

如猪苓、茯苓、雷丸等食用兼药用菌。

（3）菌索组织分离法：

它是从食用菌菌索种分离培养得到纯菌丝的方法。

如蜜环菌、假蜜环菌等食用菌。

（二）孢子分离法

利用子实体产生的成熟有性孢子分离培养获得纯菌种的方法。

2、特点

（1）属于有性繁殖，后代易发生变异，可用此法培育新品种。

（2）分离过程较复杂，适用于胶质菌类和小型伞菌。

3、操作过程

种菇选择→种菇消毒→采集孢子→接种→培养→挑菌落→纯化菌种→母种

4、几种方法

（1）单孢子分离法

用于杂交，选育新的优质菌种。

①平板稀释法

②连续稀释法

（2）孢子印分离法

取成热子实体经表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上，在20～24℃静置一天，大量孢子落下形成孢子印，然后移少量孢子在试管培养基上培养。

（3）孢子弹射分离法

①悬钩法

剪取一小块新鲜的耳片组织，悬挂在盛有培养基的三角瓶的棉花塞下方或培养皿的上盖内面，放在25℃温箱中或室温下，2～3天后，耳片上的担孢子会弹射到下面的培养基表面，萌发后形成胶质菌落。

2、孢子分离法：

是用食用菌成熟的有形孢子萌发培养成菌丝体而得到菌种的方法。

（三）基质分离法（菇木分离法）

从生长子实体的培养基中分离菌丝获得纯培养的方法。

（1）污染率高。

（2）子实体已腐烂，但又必须保留该种菌种。

（3）有些子实体小而薄，用组织分离法和孢子分离法较困难。

（4）还有一些菌类如银耳菌丝，只有与香灰菌丝生长在一起才能产生子实体，如果要同时得到这两种菌丝的混合种，也只能采用基内菌丝分离法进行分离。

菇木选择→菇木消毒→切块接种→培养纯化→母种

二、菌种分离提纯

1、选择性培养基

抗霉培养基：

涕必灵（TBZ）或多菌灵（MBC）培养基

抗菌素：

四环素、氯霉素、链霉素、金霉素等。

2、排除细菌性污染

利用某些大型真菌在温度较低（20～25℃）时，菌丝生长比细菌要快的特点，用接种针切割菌丝的前端，接种到斜面培养基上（无冷凝水、硬度高），连续2～3次就能获得纯菌丝。

3、排除霉菌污染

切割法、基内菌丝挑取法

4、菌丝再提纯

三、出菇试验

包括菌丝生长速度、吃料能力、菌丝形态特征、生理生态特性、出菇速度、菇体形态特征、产量、质量等。

标题五>

第五节食用菌菌种的扩繁与培养

引言：

从外地购进或分离获得的母种数量有限，不能满足生产的需要时，要对初次获得的母种进行扩大繁殖，以增加母种数量。

一、菌种扩大

把接种物移至培养基上，在菌种生产工艺上称接种。

在栽培工艺即生产中称播种。

条件：

无菌操作（接种箱或超净工作台、酒精灯火焰周围10cm）

1、母种扩接方法（超净工作台内接种，由试管到试管）

将试管菌种接到新的试管斜面上扩大繁殖，称为继代培养，转管。

程序：

P43

（1）消毒手和菌种试管外壁。

（2）点燃酒精灯。

（3）用左手的大拇指和其他四指并握要转接的菌种和斜面培养基，在酒精灯附近拔掉棉塞。

（4）在酒精灯灼烧接种锄和试管口。

（5）冷却接种锄，取少量菌种（绿豆大小），至斜面培养基上。

（6）塞上棉塞，贴好标签。

整个过程要快速、准确、熟练。

1支→30支

2、原种扩接方法（超净工作台内接种，由试管到瓶或塑料袋）

（1）消毒手和母种试管外壁。

（3）拔掉母种棉塞，在酒精灯火焰上灼烧试管口和接种锄，将母种固定。

（4）拔掉菌种瓶棉塞，取2块1cm2菌种，至菌种瓶内。

（5）塞上棉塞，贴好标签

1支母种→10瓶原种

3、栽培种扩接方法

（1）原种瓶棉塞进行消毒处理。

（2）消毒手和原种瓶外壁。

（3）点燃酒精灯。

（4）拔掉原种棉塞，在酒精灯火焰上灼烧原种瓶口和接种匙，将原种瓶固定。

（5）拔掉菌种瓶棉塞，将表面的老菌种块和菌皮挖掉，用接种匙捣碎菌种，取满勺菌种至栽培袋内。

1瓶原种→20瓶栽培种

二、菌种的培养

1、母种培养

（1）适温培养

在恒温箱（室）培养

种块有萌发，并向培养基上蔓延后，将培养温度降低2～3℃，促使菌丝健壮生长。

（2）注意通风

通风不足，菌丝生长缓慢，棉塞上易滋生霉菌。

（3）定期检查

前几天，要逐管检查，以防掩盖杂菌。

发现污染，及时淘汰。

（4）详实记录

记录菌株来源、转接时间、培养基种类、发菌的温湿度、菌丝生长情况，以及污染现象、数目。

2、原种和栽培种的发菌培养

在菌种培养室培养：

在培养过程中，菌丝生长代谢释放出呼吸热，料温上升，较室温高2～5℃，温差视菌种量多少和通风保温情况而定，及时调整室温。

在冬季，可利用此热量增加培养温度，但在夏季或气温较高时，则要防止烧菌。

（2）注意通风、避光培养

萌发是否正常、有无污染、生活力和生长势。

（4）及时使用

原种满瓶7～8d，栽培种满袋10～15d，菌丝处于最佳生长期。

暂时不用，应低温、干燥、避光保存。

三、菌种培养中常见的异常情况及原因

1、母种常见的异常情况及原因

（1）培养基凝固不良

（2）接种物不萌发

（3）菌种生长过慢或长势不旺

（4）菌种生长不整齐

（5）细菌污染

（6）真菌污染

2、原种和栽培种常见异常情况及原因

（1）接种物不萌发，菌种被烫死或接种时培养料的温度太高。

〈1〉瓶壁出现不规则的杂菌群落，主要是灭菌不彻底所制。

〈2〉在培养料面出现杂菌，是由于接种过程中未达到无菌操作要求而造成污染。

〈3〉接种块上发生杂菌，是由于菌种不纯带入杂菌而引起的。

〈4〉瓶内菌丝长到半瓶而不再向下延伸，由于培养基料中水量过高或装瓶时培养料压得太坚实而致。

标题六>

第六节菌种质量鉴定

菌种鉴定（6方面）：

纯度、长势、菌龄、均匀度、出菇快慢。

出菇试验是最可靠、最实际的方法。

产量高、品质好→优良菌种

一、母种质量鉴定

控制转管次数，转管2～3次为宜，最多不超过4次。

（菌种培养的时间越长，菌龄越大，生活力下降，菌种易老化）

1、出菇试验

菌丝生长健壮，出菇快、朵形好、产量高，为优良菌种。

2、外观肉眼鉴定

外表菌丝浓白、粗壮、富有弹性，则生命力强；

菌丝已干燥、收缩或菌丝自溶产生大量红褐色液体，则生活力降低。

3、长势鉴定

菌丝生长快、整齐，浓而健壮，是优良品种。

4、温度适应性鉴定

一般菌类在30℃，高温型菌在35℃，培养4h，

在高温下，仍能健壮生长，为优良菌种；

在高温下，菌丝萎缩，为不良菌种。

5、干湿度鉴定

能在偏干或偏湿培养基上生长良好的菌种，为优良菌种。

二、原种和栽培种的质量鉴定

1、菌种传代和菌龄应在规定范围内

（1）用转管在4～5次以内的母种生产的原种和栽培种。

（2）一般食用菌的原种和栽培种，在常温下可保存3个月内有效；

草菇、灵芝、凤尾菇等高温型菌则保存1个月内有效。

超过上述期限的菌种，即使外观健壮，生产上也不使用。

2、原种及栽培种外观要求

（1）菌丝生长健壮，绒状菌丝多，生长整齐。

（2）菌丝已长满培养基，银耳的菌种还要求在培养基上分化出子实体原基。

（3）菌丝色泽洁白或符合该菌类菌丝特有的色泽。

（4）菌种瓶内无杂色出现和无杂菌污染，。

（5）菌种瓶内无黄色汁液渗出，反之，表明菌种老化。

（6）菌种培养基不能干缩与瓶壁分开。

还应区分开原种和栽培种。

3、常见优质原种和栽培种的性状

（1）平菇：

菌丝粗壮，浓白，密集，爬壁力强，菌柱断面菌丝浓白，清香，无异味，发菌快。

（2）金针菇：

菌丝洁白，较粗壮，密集，长绒毛，外观似细粉状，培养后期菌种表面易产生菇蕾。

（3）香菇：

菌丝洁白，绵毛状，后期见光易分泌出酱油色液体，呈褐色，有时表面产生小菇蕾。

（4）双孢蘑菇：

菌丝灰白带微蓝，密集，细绒状，气生菌丝少，贴生菌丝在培养基内呈细绒状分布，有特有的蘑菇香味。

标题七>

第七节菌种保藏和复壮

菌种是重要的生物资源，也是教学、科研和生产的基本材料，因此菌种研究和菌种保藏具有重要的意义。

一、菌种保藏的目的和原理

保藏目的：

使菌种不死亡、不衰退、不被杂菌污染，能长期在生产上应用。

保藏原理：

是使菌丝的生理代谢活动尽量降低。

通常采用的手段是低温、干燥和减少氧气供应。

二、菌种保藏方法

1、斜面低温保藏最常用、最简便的方法。

保藏方法：

一般，在4℃冰箱（草菇在10～15℃）

措施：

（1）使用营养丰富的半合成培养基；

（2）加大琼脂用量到2.5%；

（3）加上0.2%磷酸二氢钾；

（4）增加每管培养基的装量，不少于12ml；

（5）用石蜡封口；

（6）冰箱温度稳定；

（7）培养基出现干缩时，及时转管；

（8）第1次扩接时，尽量多扩试管，并作多处理。

保藏期：

3～6个月。

使用时：

提前12～24h取出，室温培养活化后，才能转管使用。

2、液体石蜡保藏——矿油保藏

液体石蜡覆盖在菌种上，防止培养基水分散失，使菌丝体与空气隔绝，抑制新陈代谢。

石蜡灭菌→除水→无菌条件下，菌种加石蜡，淹过斜面1cm→在4℃冰箱或常温下，垂直保藏。

5～7年。

需垂直放置、运输不便、易燃。

直接挑取菌丝；

菌丝生长弱，需经再次转接培养。

3、麦粒保藏菌种

选择麦粒→浸泡8～12h→稍加晾干，分装试管1/3～1/4→灭菌→接种，长满→干燥1个月→在4℃冰箱或常温下，保藏。

1年以上。

1粒麦粒/支。

此外，还有许多菌种保藏方法，如砂土保藏、滤纸保藏、液氮超低温保藏、真空冷冻保藏等。

三、菌种退化原因及复壮

在菌种繁殖过程中，往往会发现某些原来优良性状渐渐消失或变劣，出现长势弱、生长慢、出菇迟，产量低质量差等变化。

这就是“退化”。

1、菌种退化的原因

（1）菌种遗传性状分离或突变

（2）可能感染病毒

（3）菌龄变大

（4）不适的培养和保藏条件

2、菌种复壮的措施

（1）纯种分离法。

（2）变化培养基复壮。

（3）控制传代次数，组织分离/年，孢子分离/3年。

（4）创造良好的培养条件和有效的菌种保藏方法。

八节良种选育

一、食用菌的遗传与变异

食用菌遗传变异的特性→是良种选育的基础

遗传：

子代与亲代性状相似的现象。

变异：

子代与亲代性状的差异现象。

二、良种选育方法

（一）人工选种

1、原理

食用菌的种性是通过菌丝体的繁衍逐代传递的，所以自然选择就侧重于在不同菌株之间进行，而不是在同一菌株的后代中进行。

2、方法

收集品种资源→生理性能测定→品种比较试验→扩大、示范推广

（1）品种资源的收集

尽可能的收集有足够代表性的野生菌株。

确定采种的目标，采集点的地理条件，并做好详细的采集记录。

（2）生理性能测定

标本采集后应尽快采用多种分离方法获取菌株，随后，立即用平板做拮抗试验（即分离的菌株菌丝两两配对接入同一平板培养基内），适温培养，经十余日，不同菌株的菌落内是否出现拮抗线，同时还可在平板或生长测定管上测定菌丝生长速度及对温度的反应。

（3）菌株比较

比较各菌株的优劣，详细记录各菌株的产量、菇形、温性、干鲜比、始菇期、菇潮间隔、形态等。

为了试验的准确性，要保证菌种的质量，培养基配方，接种，管理措施等可能影响结果的因素，尽可能使之一致。

试验还应按生物统计原理进行安排。

（4）扩大试验

上述的品种评比结果仅是个阶段性的成果，还应和当地的当家菌株同时进行栽培，证实它是更优良的菌株。

（5）示范推广

经扩大试验后，将选出的优良品种放到有代表性的试验点进行示范性生产，待试验结果进一步确定之后，再由点到面推广。

（二）诱变育种

出发菌株→生理性能测定→品种比较试验→扩大、示范推广

（三）杂交育种

食用菌的杂交是指不同种或种内不同株系之间的交配，后者则理重要。

选择亲本→单孢子分离→单孢子杂交配对→转管繁殖→初次筛选→复筛→小面积栽培试验→大面各示范推广→定名申批

1、选择亲本

2、单孢子分离

3、单孢子杂交配对

4、转管繁殖

将可亲和的组合移入新的斜面保存备用。

四极性的异宗结合的食用菌，由于自交不育，经配对后，凡出现双核菌丝的组合，并能正常结实者，即证明杂交成功。

次级同宗结合食用菌（如双孢蘑菇），首先经过单孢子分离、培养，获取不孕菌丝。

随后进行不孕性菌丝间的配对。

5、初次筛选

经过初步筛选，淘汰大部分表现一般的菌株。

经初筛后再做出菇试验比较，选出优良菌株。

6、复筛

通过栽培比较，选出少数性能优良的菌株。

出菇鉴定包括如下几个方面：

①菌丝生长速度：

②出菇菌块（袋）的表型特征：

③子实体表型特征：

④测定其最适生长温度、湿度等。

⑤计算子实体的产量

7、小面积栽培试验

将复筛菌株置于不同地域的栽培区进行栽培，以考察其适应性与性状的稳定性，并做相关的详细记录。

8、大面各示范推广

逐步扩大栽培面积，进行示范性的推广，将种性优良、优质高产的菌株逐渐定为当家菌株。

9、为确定保留下来的杂交新品种正式定名，并申请有关部门批准。

（四）育种新技术

1、基因工程

2、原生质体融合技术

细胞工程重点研究和开发的是细胞融合技术和细胞培养技术。

细胞融合技术是人们按照需要，使两个不同遗传特性的细胞，融合成一个新的杂种细胞，从而人工构建新型细胞，这个细胞兼有两个亲代细胞的遗传特性

思考题：

1、什么叫食用菌菌种？

有哪些类型？

2、食用菌制种需要哪些条件？

3、什么叫食用菌菌种培养基？

总结一下，配制母种培养基应注意哪些问题。

4、简述菌种生产的基本过程？

5、食用菌菌种的分离有哪些方法？

生产中最常用的是哪一种，其操作过程如何？

6、优质的母种、原种和栽培种一般应符合哪些要求？

7、试述食用菌菌种保藏的目的、原理和基本手段？

8、怎样进行斜面菌种的低温保藏？

提高保藏效果有哪些措施？

9、什么叫食用菌菌种的退化和复壮？

菌种退化的原因？

菌种复壮的方法