基因工程复习V21.docx

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基因工程复习V21

第一章绪论

名词解释（镇鸿）

基因工程：

通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。

基因操作：

泛指对基因进行酶切、连接、转化等分子生物学操作，是基因工程的技术基础。

遗传工程：

根据遗传学原理，按照人们预先设计的生物蓝图，对生物的遗传物质进行有计划的操作，以达到定向改造生物的遗传组成，使其获得新的遗传性状，这个工程称为遗传工程。

包括常规的有性杂交育种，染色体工程，细胞工程以及基因工程等。

基因克隆：

是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，它在技术上包括载体构建、大肠杆菌遗产转化改良。

1、什么是基因工程？

它包括哪些环节？

基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。

具有以下几个重要特征：

（1）打破物种的界限，实现跨物种的基因转移；

（2）通过已知功能基因的遗传转化，可进行物种的定向改良；（3）可以创造出自然界中原本没有的生物。

它包括以下环节：

①目的基因克隆②载体的准备③目的基因与载体的连接④重组DNA转转染/转导  ⑤重组体的筛选与鉴定⑥重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用

2、基因工程与基因操作、基因克隆、遗传工程等概念有什么异同？

基因操作泛指对基因进行酶切、连接、转化等分子生物学操作，是基因工程的技术基础。

基因克隆是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，它在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节，很多时候并不涉及动物、植物等的转化及性状的遗传改良，显然与基因工程不完全一致。

遗传工程广义的是指所有能改变生物体遗传性状的技术，包括常规的有性杂交育种、染色体工程、细胞工程以及基因工程等。

3、基因工程的基本条件有哪些？

它们各自在基因工程中起着什么作用？

①目的基因:

 是开展基因工程的目标和物质基础。

②载体:

 是运载工具，引入的外源基因到宿主细胞中，使其进行复制或表达。

③工具酶:

 指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶。

④受体细胞:

摄取外源目的DNA并使其稳定维持和表达。

4、基因工程的技术策略有哪些？

（1）强化基因的表达，通过增强目标性状对应基因的拷贝数，提高目的酶表达量与活性，实现目标性状的改良。

（2）关闭特定基因的表达，实现目标性状的改良。

（3）基因的异源表达赋予生物新的功能。

第二章：

基因工程酶学基础

名词解释（仁杰）

限制性内切酶：

能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其附近切割双链DNA的一类内切核酸酶。

黏性末端：

DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构。

平末端：

限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段为平末端。

同切点酶：

又称同裂酶，是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。

同尾酶：

来源不同，识别靶序列也不同，但切割后能产生相同的黏性末端的限制性内切核酸酶。

DNA连接酶：

能催化双链DNA片段靠在一起的3'羟基末端和5'端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。

DNA聚合酶：

在引物和模板存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3'-OH末端，催化核苷酸的聚合作用的一类酶。

反转录酶：

依赖于RNA的DNA聚合酶，普遍存在于含RNA的反转录病毒中，以RNA为模板，催化合成互补的DNA单链，进而合成DNA的第二条链。

末端脱氧核苷酸转移酶：

简称末端转移酶（TDT），一般从小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白，在末端转移酶的催化下将脱氧核苷酸添加到DNA分子的3'-OH末端，伴随无机磷酸的释放。

碱性磷酸酶：

能够催化核酸分子脱掉5'的磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5'-P末端转化成5'-OH末端。

脱氧核糖核酸酶I：

简称DNA酶I（DNase I），来源于牛胰脏的糖蛋白，需要二价阳离子的内切核酸酶，能从嘧啶核酸5'端磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成具有5'磷酸末端的寡核苷酸。

（有Mg2+存在时，DNase I能在双链DNA上随机独立的产生切口，在Mn2+存在时，则在双链DNA的大致同一位置上切割，产生平末端DNA片段。

）

（力坤）

1.II型限制性内切核酸酶的基本特性有哪些？

II型限制性内切核酸酶只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，其识别和切割DNA分子具有严格的特异性。

①识别序列的特异性：

识别序列为4-6bp的双重螺旋对称结构的回文序列

②切割位点的特异性：

在识别序列内或附近特异切割双链DNA分子，水解磷酸二酯键，产生3’端羟基、5’端磷酸基团的DNA片段。

2.大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值？

【

（1）5'→3'聚合酶活性

大肠杆菌DNA聚合酶I的聚合酶活性是以DNA为模板，利用体系中的4种脱氧核糖核苷（dNTP），催化单核苷酸分子加到引物的3'-OH末端，沿5'→3'合成与模板互补的另一条DNA链，模板DNA可以是单链或双链DNA分子，双链DNA只有在其一条链上有一个或数个断裂时才可以作为有效模板。

（2）3'→5'外切酶活性

大肠杆菌DNA聚合酶I的3'→5'外切酶活性是沿3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸，这种外切酶活性在体内DNA复制时主要起校对作用。

当DNA复制中掺入的核苷酸与模板不互补而游离时就会被其3'→5'外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。

这种校对功能保证了DNA复制的真实性，从而降低突变率。

（3）5'→3'外切酶活性

大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性，是从5'端降解双链DNA分子。

它也可以降解DNA:

RNA杂合体中的RNA分子，即具有RNA酶H的活性。

这种酶外切活性特点是：

待切除的核酸分子必须具有5'端游离磷酸基团；核苷酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺旋区段上；被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱氧核苷酸。

】

3.Klenow片段和大肠杆菌DNA聚合酶I有何异同？

【

（1）Klenow片段是来自大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段；

（2）DNA聚合酶I具有5’→3’聚合酶活性，3'→5'核酸外切酶活性，5'→3'核酸外切酶活性；

Klenow片段只有5’→3’聚合酶活性，3'→5'核酸外切酶活性。

】

4.为什么说反转录酶是一种特殊的DNA聚合酶（自己总结的），其主要用途是什么？

反转录酶是依赖于RNA的DNA聚合酶。

它有合成DNA的活性，只不过模板是RNA，这与一般DNA聚合酶不同。

主要用途：

①以mRNA为模板合成其互补DNA（cDNA），用于构建cDNA文库和基因克隆；②对具5’端突出的DNA片段的3’端进行补平和标记，制备杂交探针；③代替大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段或测序酶，用于DNA序列分析。

5.【几种不同的修饰性工具酶在基因工程中具有的重要用途。

】

∙末端脱氧核苷酸转移酶

o用于克隆DNA片段：

将同聚物尾巴添加到3’末端

o用于DNA片段3’末端标记。

o按照模板合成多聚核糖核苷同聚物

∙多核苷酸激酶

o标记DNA或RNA的5’末端。

o在DNA分子连接时，对缺乏5’磷酸基团的DNA片段或人工合成接头进行磷酸化处理。

∙碱性磷酸酶

oDNA分子片段5’末端的去磷酸化，防止自身连接。

o在5’末端标记之前，去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基团。

第三章载体

名词解释（旭华）：

{红色部分为11.27添加整理}

1.载体：

能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具就称为载体（vector）.

2.克隆载体：

用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体（目前主要有：

质粒载体、噬菌体载体、黏性载体、人工染色体等）。

3.表达载体：

表达载体是可携带DNA片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。

（一般在克隆载体的基础上增加了基因表达的调控元件。

）

4.质粒载体：

（P38-39页归纳）通过存在于多种宿主细胞、独立于染色体外的可自主复制闭合环状的质粒进行人工改造（选择合适的复制起始位点、加入合适的选择标记基因、增加或减少酶切位点、缩短长度）而构建的克隆载体。

5.质粒的不相容性：

两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象称为质粒的不相容性（相反则称为相容性）。

6.RNAi：

双链RNA（double-strandsedRNA,dsRNA）对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰（RNAinterference,RNAi）

7.噬菌体载体：

基因克隆另一类重要的载体是病毒载体。

噬菌体主要有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类。

双链噬菌体为λ类噬菌体，单链丝状噬菌体有M13、f1、fd噬菌体。

重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有λ类噬菌体和M13噬菌体。

（来自XX百科，参照课本自行理解。

）

8.黏粒克隆载体：

粘粒克隆载体由质粒和含有cos位点的λDNA片段所组成，大小一般在5~7Kb,包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA的cos位点，既可以转化大肠杆菌并按质粒复制的方式进行复制，又可以承载40Kb左右的外源DNA片段。

由于黏粒载体带有噬菌体的包装序列，可以用包装蛋白包装，不带外源DNA片段的载体因为包装下限而不能被包装，具有很强选择性。

包装产物通过感染宿主菌高效地将重组DNA导入宿主细胞。

黏粒载体被用于构建基因组文库。

9.人工染色体：

染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体（artificialchromosomevector），其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。

10.质粒表达载体：

质粒表达载体是在以质粒为基本骨架的克隆载体的基础上，组装启动子、转录终止子和核糖体结合位点等表达原件而构成的。

11.大片段表达载体：

（找不到概念，详见课本例子P59：

TAC（可转移人工载体）、MAC（哺乳动物人工染色））

12.VIGS:

病毒诱导的沉默基因（virusinducedgenesilencing，VIGS）是利用植物体内天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株植物，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内源的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。

简答：

2.什么是克隆载体，克隆载体必须满足哪些基本条件？

克隆载体是用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体。

必须满足如下基本条件：

具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；具有由单一限制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点（MCS），可供外源基因的插入；具有合适的选择性标记，用于含有重组质粒的宿主细胞筛选。

3．质粒具有哪些特性？

复制：

质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及与此相关的顺式作用元件，它们使质粒独立于宿主细胞的染色体自主复制并保持其固有的遗传信息及相对稳定的拷贝数。

不同质粒在宿主细胞内的拷贝数可以是不同的，根据其数量可将质粒复制方式分为严谨型（1至数个）和松散型（10个以上）；

质粒的不相容性：

在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒一般不能够在同一宿主细胞中稳定共存；

质粒的转移性：

含有tra基因的质粒会促使宿主细胞与受体细胞接