小麦玉米转基因植株的抗性鉴定Word文档下载推荐.docx

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2.1.2植物材料8

2.1.3菌株和载体9

2.2实验方法9

2.2.1转基因植株的鉴定9

2.2.1.1转化株的PCR检测9

2.2.1.1.1转基因植株DNA的微量提取（CTAB法）9

2.2.1.1.2转基因植株的PCR鉴定9

2.2.2转化株的PPT涂叶检测10

2.2.3真菌病害抗性鉴定10

2.2.3.1小麦赤霉病抗性鉴定10

2.2.3.2玉米纹枯病抗性鉴定10

3.结果与分析11

3.1转化株的PCR检测11

3.2转化株的PPT涂叶检测12

3.3转化株的真菌抗病性鉴定13

3.3.1小麦赤霉病的抗性鉴定13

3.3.2玉米纹枯病的抗性鉴定4

4.讨论15

5.结论16

参考文献17

致谢18

Contents

Abstract1

Englishabstract2

1Introduction3

1.1PlantPGIPProfile3

1.2Progressinidentificationoftransgenicplants3

1.2.1Theuseofmarkergenes3

1.2.1.1Selectablemarkergene3

1.2.1.2Reportergene4

1.2.2Moleculardetection4

1.2.2.1Molecularmarkers5

1.2.2.2Molecularhybridization5

1.2.3Immunoassaytechnology6

1.2.3.1ELISA.6

1.2.3.2Immunofluorescencetechnique6

1.3.wheatscabblotchfungaldiseasesofcornsheathblightartificialinoculationmethod7

1.3.1WheatFusariumheadblightartificialinoculationmethods7

1.3.2Maizesheathblightartificialinoculationmethods7

1.4Thepurposeandsignificanceofthisstudy8

2Materialsandmethods8

2.1Experimentalmaterials8

2.1.1Thetargetgene8

2.1.2Plantmaterial8

2.1.3Strainsandvector9

2.2Experimentalmethods9

2.2.1Identificationoftransgenicplants9

2.2.1.1PCRdetectionoftransformingstrains9

2.2.1.1.1SwitchtotransgenicplantsDNAExtraction（CTAB）9

2.2.1.1.2PCRidentificationoftransgenicplants9

2.2.2TransformingstrainsPPTcoatingsolutiondetection10

2.2.3Identificationoffungaldiseaseresistance10

2.2.3.1Wheatscabresistanceidentification10

2.2.3.2Identificationofcornsheathblightresistance10

3ResultsandAnalysis11

3.1PCRidentificationoftransgenicplants11

3.2TransformingstrainsPPTcoatingsolutiondetection12

3.3Identificationoffungaldiseaseresistance13

3.3.1Wheatscabresistanceidentification13

3.3.2Identificationofcornsheathblightresistance14

4Discuss15

5Conclusion16

References16

Acknowledgement17

摘要：

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonaseinhibitingprotein，PGIP）是一种富含亮氨酸重复的细胞壁结合蛋白。

它是一种特异性蛋白，能够非竞争性地抑制病原菌的内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase，endo-PG）活性，增强植物的抗病性。

当植物受到病原菌、机械创伤、热胁迫或化学乃至激素因子的挑战，PGIP基因易于表达，可表现出某种程度的抗病性。

本研究主要是针对通过植物基因工程方法已经获得PGIP基因的禾本科作物小麦和玉米，研究小麦玉米转基因植株对真菌病害如小麦赤霉病、玉米纹枯病的抗性。

本研究的主要结果和结论如下：

对小麦转化品种扬麦158进行小麦赤霉病的抗性鉴定，结果显示转基因小麦表现出抗性；

对玉米转化品种A188和齐319进行了玉米纹枯病的抗性鉴定，结果显示转基因玉米表现出抗性。

关键词：

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白；

小麦；

玉米；

转基因植株；

抗性鉴定

ResistanceIdentificationofWheatandCornTransgenicPlants

Abstrac:

Polygalacturonaseinhibitingprotein（PGIP）isaleucine-richcellwallbindingprotein.PGIPisakindofspecificproteinswhichcanwhichcannon-competitivelyinhabiteendo-polygalacturonase（endo-PG）ofpathogensandenhanceresistanceofplan.whenplantsmetpathogen,mechanicaltrauma,thermalorchemicalstress,PGIPgeneiseasytoexpressandinhabittheactivityofPGs,evenmoreshowresistance.Inthisstudy,weusethettransgenicwheatandmaizewhichhavetheclonedPGIPgene,andcanshowresisitancetofungalpathogenssuchasGibberallazeae,Pelliculariasasakii,Exerohilumtrucicum,Bipolarismaydis.

Themainresultsandconclutionsareasfollows,

Yangmai158transgenicwheatplantsshowedresistantofGibberallazeaeandA188andQi319maizetransgenicplantsshowedresistanttofungalpathogensofBipolarismaydis,Exerohilumtrucicum,andPelliculariasasakiiafterinoculationwiththesefungi.

Keyword:

polygalacturonaseinhibitingprotein;

wheat;

maize;

transgenicplants；

Agrobacteriumtumefaciens-mediated

1引言

1.1植物PGIP概况

研究发现多种植物体内含有PGIP基因，这类基因承受了较小的进化压力，进化速率较快，致使有些植物如禾谷类作物的PGIP基因已经丢失，而多数茄科类作物留了这类基因，甚至已成为持家基因。

植物正常生长发育过程中PGIP基因很难高效表达，但当植物受到病原菌、机械创伤、热胁迫或化学乃至激素因子的挑战，PGIP基因易于表达，并对PGs活性产生一定的抑制效果，甚至表现出明显的抗病性[1]。

1.2转基因植株的鉴定方法的研究进展

植物外植体经过农杆菌等介导或DNA的直接转化后，大部分转化体包括细胞、组织、器官或植株是没有转化的，只有少数被转化,这就需要采用特定的方法将未转化的细胞、组织、器官或植株与转化的区分开来，淘汰未转化的。

目前，应用于转基因植株的鉴定方法可分为利用标记基因进行鉴定、分子检测和免疫技术三大类，现简要分述如下。

1.2.1标记基因的使用

标记基因，包括选择标记基因和报告基因。

它常常用于植物遗传转化中筛选和鉴定转化的细胞、组织、器官和再生植株，通常与目的基因构建在同一植物表达载体上，一起转入受体。

有时标记基因本身也可作为目的基因转入受体，用于基因遗传转化的基础研究或获得抗除草剂转基因植株。

1.2.1.1选择标记基因

选择标记基因包括抗生素抗性基因和除草剂抗性基因等。

在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转化细胞、组织、器官和植株死亡,转化的由于有抗性,可继续存活。

常用的抗生素基因有apr（抗氨苄基因）、tcr（抗四环素）、cmr（抗氯霉素）、kmr（抗卡那霉素）、neor（抗新霉素）、hygr（抗潮霉素）等。

其原理是抗性基因编码的蛋白（酶）可对抗生素药物进行乙酰化、腺苷化、磷酸化等化学修饰或水解，从而破坏了抗菌素的作用，使细胞产生抗药性。

从分子生物学角度而言,此类抗生素会造成:

细胞壁合成受阻，抑制蛋白质的合成，抑制DNA的功能，也抑制RNA的合成等。

这些选择标记基因已在转基因植物中广泛应用。

对于抗生素不敏感的植物，可采用抗除草剂基因。

由于含抗除草剂基因的转基因植株对人畜无毒害作用，是很有价值的选择标记基因。

同时，抗除草剂基因在植物遗传转化中可同时用作选择标记和培育抗除草剂的作物。

膦化麦黄酮基因用来代替卡那霉素抗性基因，在转基因谷类中得到应用。

目前，加拿大已有两个抗草甘膦的油菜品系。

除草剂抗性基因的功能主要是：

它们是某些酶的抑制剂，进一步抑制氨基酸蛋白质的合成。

将抗除草剂基因转入植物体中，为除草剂的推广使用奠定了基础。

1.2.1.2报告基因

报告基因能够快速报告细胞、组织、器官或植株是否被转化。

它是一个表达产物非常容易被检测的基因，把它的编码序列与调节基因表达的DNA序列相融合，在调控序列控制下进行表达。

报告基因大多是一些酶的基因，利用加入相应底物，酶活性是否存在，而相应地指出目的基因是否转化。

许多报告基因利用其光学特性，显示其报告功能叶植物农杆菌转化中常用农杆碱合成酶类,这类报告基因都是合成农杆碱的特异酶类基因，检测时加入相应的前体，利用其酶活性,将其催化成对应的农杆碱，然后以标准农杆碱作对照,进行纸层析，经一定的呈色反应,即可判断该植株是否转化。

第二类报告基因是抗生素转化酶类，如NPT-Ê

基因[2]，这类报告酶将底物抗生素乙酰化或磷酸化。

底物进行放射性标记，将产物层析，检测其放射性，便可判断是否转化。

第三类是产物具有光学性质的酶类，利用光学活性基因的前体作为底物，在报告酶的作用下，产生光学活性物质，经过比色，荧光检测即可。

最为常用的是gus，即β-葡萄醛酸酐酶基因。

灵敏的显色底物X-Gluc和MUG存在时，极易检测。

gus报告基因已成功地用在谷子、玉米[3]、大豆[4]、油菜[5]等作物转基因研究中。

另外，β-半乳糖酐酶基因，荧光素酶基因（luc）等报告基因，在基因工程研究中亦有应用报道[6]。

随着报告基因的不断发现，一种集选择与筛选于一体的绿色荧光蛋白（GEP）出现了。

它没有种属依赖性，不需要加入底物、酶、辅因子等,只需要暴露在395nm或490nm的光下，转化的细胞、组织、器官或植株便会激发出绿光[7]。

标记基因在转基因工程中处于很重要的地位，它是外源目的基因是否转化的常用鉴定手段,而且方法简单。

为了进一步鉴定目的基因是否转入受体植株中，还需进行分子检测。

1.2.2分子检测

转基因植株的分子检测主要包括分子标记和分子杂交。

1.2.2.1分子标记

分子标记[4]常用的方法有RFLP、PCR、RAPD以及DNA指纹技术。

RFLP即限制性片断长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP），它可以检测个体间基因微细差别。

由于基因内个别碱基的突变以及序列的缺失、插入或重组，造成核苷酸序列出现差异，从而导致限制性内切酶的识别位点不同，酶切时，产生DNA片段的数目和大小不同，电泳会出现不同的片段。

PCR即聚合酶链式反应（polymerasechainReaction），是在体外对特定的DNA顺序进行扩增。

PCR检测方法简单,将少量的扩增产物和分子标记（Markers）进行琼脂糖凝胶电泳，经溴乙锭染色，在紫外光下观察，不同转化受体是否出现目的基因片段。

具有目的基因片段的植株为转基因植株，未扩增出目的基因的为非转基因植株，本实验采用的就是PCR即聚合酶链式反应（polymerasechainReaction）。

此外,利用PARD（RandomAmpilificatedpolymorphicDNA）、AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）、DNA指纹技术进行转基因植株的鉴定亦有许多报道。

分子标记都是在DNA水平上进行的鉴定，而真核生物的基因表达调控发生在多水平多层次上。

外源目的基因经过分子标记已确定被整合到受体染色体组上，但DNA与DNA之间配对，以配对的DNA作为信号，使DNA异染色质化或从头甲基化，另外DNA与RNA协同（association）都会造成转录水平受抑[8]，这样外源目的基因在转录水平上就检测不到了。

转录水平正常，即mRNA上能检测到外源目的基因，但由于大量RNA存在，RNA依赖的RNA聚合酶被激活，形成RNA双链，被RNases降解，造成转录后水平的抑制。

翻译及蛋白质水平上调控,也会影响外源目的基因的表达。

这就需要一定的方法进行鉴定。

1.2.2.2分子杂交

分子杂交有Southern杂交，Northern杂交及Western杂交。

其原理是依外源目的基因碱基同源性配对进行的，杂交后能产生杂交印迹或杂交带的转化植株为转基因植株,未产生杂交印迹或杂交带的为非转基因植株。

Southern杂交,是外源目的基因序列作探针与转化植株的总的DNA进行杂交，它是DNA水平上的分子鉴定方法。

Northern杂交，是外源目的基因序列作探针与DNA杂交，它是在转录水平上进行的分子鉴定方法。

Western杂交则是在翻译水平上或蛋白质水平上进行的分子鉴定方法。

分子杂交是鉴定转基因植株在各调控水平上是否整合或表达的重要方法,也可与分子标记鉴定方法配合使用[9]。

现已广泛应用于转基因植物的鉴定[10,11]。

1.2.3免疫技术

免疫技术[12]也是一种蛋白质水平上的检测手段，包括许多方面，在此只作简单介绍。

1.2.3.1酶联免疫法（ELISA）

酶联免疫法（Enzyme-likedImmunosorbentAssay,ELISA），特殊的抗体被结合固定在固体表面如微孔板上,加入样品，未被结合的成分被洗掉，然后，通过加上酶的抗体来检测抗原，未被结合的成分再次被洗掉，酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成正比。

在转基因植株中，含有抗体的均可采用此方法进行[13]。

1.2.3.2免疫荧光技术

免疫荧光,也是以抗体为基础，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，所发出的荧光,可由免疫荧光显微镜进行检测。

另外,也有利用生物鉴定方法,如转基因植株在转入抗病基因抗虫基因等之后，让其处于选择压力条件下，如果产生抗性,就证明是转基因植株。

还可采用统计的方法，尤其是对其基因产物，是否符合孟德尔规律或其它遗传规律。

陈章良用Ti质粒与大豆7S储藏蛋白基因构成重组子，导入矮牵牛中，检测7S的储藏蛋白，结果发现符合了3:

1的分离比[14]。

还可利用形态学、细胞学、差异显示毛细管电泳，蛋白质毛细管电泳分析[15]等进行转基因植株的鉴定。

各种遗传转化方法能够成功地将外源目的基因转入植物中，但农杆菌介导法适合于双子叶植物;

基因枪法适合禾谷类作物但所需技术复杂成本高，农杆菌介导的真空渗入法，方法简单，结果可靠，效率高，且不需要经过组织培养，即可获得大量转基因植株，是值得研究与推广的一种方法。

现有的不同遗传转化方法有不同的局限性,但其共同的缺陷是遗传转化率低，尤其是在人们赖以生存的经济作物上转化率很低。

因此探讨简便、快速、高效的遗传转化体系是今后相当长一段时间内植物遗传转化的重要课题。

现有的植物遗传转化方法尚难做到定位，定量，并得到稳定高效地表达和遗传，因此外源目的基因在不同水平、层次上的调控表达的鉴定方法显得尤为重要。

随着分子生物学和生物技术的不断发展，逐步完善现有植物遗传转化方法及转基因植物鉴定方法或创造出新的高效遗传转化方法，逐步做到外源目的基因定点插入，高效表达，是今后植物遗传转化工作者光荣而艰巨的使命。

1.3.小麦赤霉病、玉米纹枯病真菌病害人工接种方法的研究进展

1.3.1小麦赤霉病人工接种方法

小麦赤霉病是一种直接危害穗部的病害，在全世界普遍发生，主要分布于潮湿和半潮湿区域，尤其气候湿润多雨的温带地区受害严重。

从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中为害最严重的是穗腐。

一旦发生小麦赤霉病，可引起小麦穗枯、穗腐，使部分小穗或整穗成灰色枯死，潮湿时在病部产生红色胶质霉层，严重发生年份，会使小麦减产严重。

利用赤霉病菌分生孢子进行人工接种试验，即采用不同孢子浓度接种和不同接种次数以使小麦群体产生不同严重程度的赤霉病病情，得到接种菌量与赤霉病发生程度的定量结果[16,17]。

将菌种经扩繁培养后，于接种前用绿豆汁洗菌种制成孢子悬浮液，设置若干个浓度梯度处理，于小麦扬花期，在保证侵染所需的温湿度条件下，每小区设置定量孢子液均匀喷雾，在发病初期和终期两次调查小区的病穗率和病情指数[18]，鉴于本实验所用转化植株数量较少，仅研究转化小麦植株对真菌病害的抗病性情况。

1.3.2玉米纹枯病人工接种方法

随着紧凑型玉米品种的大面积种植，玉米栽培密度提高，氮肥用量增加，致使玉米田田间郁闭度加大，造成有利于玉米纹枯病发生的小气候条件，加上目前的玉米主栽品种均不抗病，近年来玉米纹枯病危害迅速上升，成为玉米上的一种重要病害。

玉米纹枯病（RhizoctoniasolaniKtlhn）由丝核菌属真菌寄生引起[19]。

该病害一般在授粉期至抽雄期，植株下部近地表叶鞘开始发病，逐渐向上部扩展蔓延至叶片和果穗，严重时引起籽粒腐烂，若不及时治疗，将严重影响产量和品质。

叶鞘病斑初为水渍状、椭圆形或不规则，各病斑相连而呈现云纹状并包裹整个茎杆，当湿度高时，病部展出稀疏的白色菌丝体和褐色小菌核。

玉米纹枯病主要采用牙签嵌入接种法：

参照陈厚德等的方法[20]，选木质牙签排在培养皿里，加入培养基（淹没牙签1/3），灭菌后接种培养玉米纹枯病菌，待菌丝密集地布满牙签时，用于接种。

接种时期掌握在玉米拔节期，基部节间定长时，选择贴近地面叶鞘，用镊子将短牙签轻轻嵌入叶鞘与茎秆之间，并在相应茎秆挂好标牌，接种后喷雾保湿[21,22]。

1.4本研究的目的和意义

研究发现多种植物体内含有PGIP基因，植物正常生长发育过程中PGIP基因很难高效表达，甚至已成为持家基因，但当植物受到病原菌、机械创伤、热胁迫或化学乃至激素因子的挑战，PGIP基因易于表达，并对PGs活性产生一定的抑制效果，甚至表现出明显的抗病性。

鉴于PGIP基因是一类重要的抗病基因，国外许多公司已把多个PGIP基因转入目的植物，改良或增强植物抗病性，抑制病害的发生，减少了农药使用量，产生了巨大经济效益。

长期以来，我国粮食作物抗病育种进程缓慢，现有抗病品种难以克服致病小种的交替更新，病害控制仍然依赖于化学药剂防治措施，农业种植部门急切需要抗病新品种的市场化，达到控制病害和减少农药用量的双重目的。

因此，针对我国小麦、玉米主要真菌病害发生与危害程度逐年加重的趋势，综合现有PGIP基因信息，克隆多个辣椒PGIP基因，借助细胞化学、基因和蛋白质操作技术，多层面验证其抗病功能，充分利用基因重组、基因修饰和转基因技术，改良现有小麦、玉米品种的抗病性，培育抗病新品种，达到控制病害发生与危害、减少化学药剂用量的目的，解决我国小麦、玉米生产中面临的重大问题，预期研究结果将具有可观的市场需要前景和产业化前景。

本研究的主要内容是对获得的转基因小麦和玉米进行抗性检测与评价。

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1目的基因

实验中用到的多聚半乳糖醛酸酶可逆性抑制蛋白（Polygalacturonase-inhibitingprotein，PGIP）基因由本校张修国实验室克隆。

2.1.2植物材料

2.1.3菌株和载体

2.2实验方法

2.2.1转基因植株的鉴定

2.2.1.1转化株的PCR检测

2.2.1.1.1转基因植株DNA的微量提取（CTAB法）

（1）取约200mg的新鲜幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉末，置于2.0ml的灭菌离心管中；

（2）加入600μl在65℃下已预热的2×

CTAB提取液，混匀，于65℃保温1~1.5h，其间轻缓颠倒混匀2~4次；

（3）取出离心管，冷至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:

1），轻缓混匀，低温（-20℃）静置10min；

（4）4℃，12000rpm离心15min；

（5）转移上清液于另一1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，低温（-20℃）静置10min；

（6）4℃，12