年产10吨透明质酸生产车间的初步工艺设计Word格式.docx

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与其它粘多糖不同，它不含硫。

它的透明质分子能携带500倍以上的水分，为目前所公认的最佳保湿成分，目前广泛的应用在保养品跟化妆品中。

1.1透明质酸的简介

1.1.1透明质酸的结构

分子式:

C28H44N2O23

分子量:

776.6486

透明质酸是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。

透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。

尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子（Naturalmoisturizingfactor，NMF，例如：

2%的纯透明质酸水溶液能牢固地保持98%水分。

透明质酸是一种多功能基质，透明质酸（玻尿酸）HA广泛分布于人体各部位。

其中皮肤也含有大量的透明质酸。

人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。

与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。

明质酸另一名称为玻尿酸，玻尿酸为错误译名，RESTIAIDhyaluronicacid的hyal-意思是像玻璃一样的、光亮透明的，而uronicacid指的是糖醛酸，玻尿酸与尿酸没有任何关系。

1.2透明质酸的合成原理及生产方法

随着人们年龄的增长及营养、日照、环境等因素的影响，人体合成透明质酸（玻尿酸）HA的能力逐渐下降，皮肤中透明质酸（玻尿酸）HA的含量会逐渐降低，人在胚胎时期体内透明质酸（玻尿酸）HA含量最高，出生后逐渐减少。

如果把20岁的人体内的透明质酸（玻尿酸）HA相对含量定位100%，则30、50、60岁时分别下降为65%、45%、25%。

当皮肤中的透明质酸（玻尿酸）HA含量低于某一水平时，皮肤表层的含水量会逐渐降低，造成角质层老化，皮肤就显得粗糙，出现皱纹，失去弹性，显得衰老，这一现象一般出现在25岁以后。

这也是中老年人与少年儿童皮肤差距的主要原因之一。

同时人体皮肤中透明质酸（玻尿酸）HA的破坏与紫外线有关，所以长期从事野外作业、高原生活、户外作业的人员较室内工作人员的皮肤显得粗糙。

人体双盲临床试验证明：

口服4小时后，血液中玻尿酸含量开始显著增高，12小时达到峰值，比对照组高出70倍。

连服7天后即可达到稳定的浓度。

百体专家介绍，透明质酸的主要功能有如下三点：

1、改善关节功能

2、天然的保湿润滑剂

3、防止动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等病症的发生。

透明质酸本身带有负电荷，在动物体存在于大部分的软结缔组织中。

它的水溶液为粘弹性流体，填充在细胞与胶原纤维空间之中且覆盖在某些表皮组织上。

在动物体，其主要功能乃保护及润滑细胞，调节细胞在此粘弹性基质上的移动，稳定胶原网状结构及保护它免于受到机械性的破坏。

因为透明质酸为天然性润滑以及吸震高分子，在肌腱、肌腱鞘及粘滑膜表面作为润滑剂。

透明质酸（玻尿酸）HA广泛分布于人体的结缔组织中，在牛眼玻璃体、关节腔中几乎以纯态形式存在。

存在于皮肤中的透明质酸（玻尿酸）HA，对人体表皮的新陈代谢起到重要的作用。

人体中透明质酸（玻尿酸）HA的破坏或失调，均可造成疾病。

皮肤中透明质酸（玻尿酸）HA含量的减少及破坏，可造成皮肤失水中，起皱而失去弹性，使人表皮衰老，因而，透明质酸（玻尿酸）HA又被称为抗衰老因子。

透明质酸（玻尿酸）HA是人皮肤表皮及真皮的主要基质成分之一，其生理功能是能使水分进入细胞间隙，并与蛋白质结合而形成蛋白凝胶，将细胞粘在一起，发挥正常的细胞代谢作用，起到保持细胞水分，保护细胞不受病原菌的侵害，加快恢复皮肤组织，提高创口愈合再生能力，减少疤痕，增强免疫力等作用。

同时，透明质酸是增殖细胞和迁移细胞胞外基质的主要成分，尤其在胚胎组织中是如此。

因为透明质酸的自身的特性，能使细胞保持彼此分离，使细胞易于运动迁移和增殖并阻止细胞分化。

在发育过程中，透明质酸的作用似乎是防止细胞在增殖够数或迁移到位之前过早进行分化。

在医药方面，透明质酸（玻尿酸）HA用于非甾体消炎药，关节炎治疗，眼科，心外科手术的辅助药品，在治疗烫伤、烧伤、冻伤、人造皮肤等方面，有着独到的作用

1.2.1透明质酸的合成原理

HA是由相同的二糖单体重复排列而形成的无支链的直链多聚物,其中每个二糖单体由一个N—乙酰氨基葡萄糖（Glc-Nac）以β-1,3糖苷键与葡萄糖醛酸（GIcA）交替连接而成,二糖单位间以β-1,4糖苷键连接。

透明质酸的相对分子量约为106～107分子中含有200～10000个双糖。

由于直链链轴上单糖之间氢键的作用,HA分子在空间呈刚性的螺旋柱型,其半径为200nm,柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性。

在溶液中HA结合的水分可达其本身重量的1000倍,且这些水在螺旋柱内固定不动,不易流失。

HA水溶液是一种非牛顿型流体,有着良好的粘弹性和应变性。

一般来说,溶液浓度和分子量的增加会使溶液粘度增加。

低浓度的HA溶液主要表现为粘性,而高浓度溶液则主要显示其弹性。

1.2.2透明质酸的生产方法

（一）动物组织提取法制备透明质酸的常用原料有鸡冠、脐带、眼玻璃体、猪皮等，主要工艺过程包括提取、除杂和分级分离。

从动物组织中提取透明质酸的一般过程如下：

先将组织匀浆，再用水和稀盐溶液提取；

提取用氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵沉淀；

将所得的沉淀溶解除渣后，用2～3倍乙醇沉淀所得粗品。

纯化可用乙醇或季铵盐进行反复沉淀处理，或采用酶解、超滤、离子交换等技术进一步除杂质及蛋白质。

不同组织透明质酸的提取纯化过程有一定的差别。

鸡冠中脂肪成分少，透明质酸含量高，容易绞碎，经丙酮脱脂后可直接用蒸馏水反复提3次或40～50℃热提，透明质酸含量高达0.47％。

脐带脂肪含量较鸡冠高，可用稀碱溶液（pH8）6O℃热提数次，或用水一氯仿溶液（20：

1）提取并用等体积氯仿洗涤提取液进一步脱脂，脐带透明质酸产量约为0.2％。

眼玻璃体透明质酸的提取多用NaCI溶液（0.1～1M），收率为0.64—2.4％。

猪皮中含脂肪较多，且韧性很大，不易绞碎，一般用NaOH溶液37℃保温使猪皮液化后用50％的乙醇调中性，猪皮透明质酸得率为0.7％。

动物组织提取法是当今生产透明质酸最主要的方法，但存在浓度不高、效率低、成本高、原料来源受限制等缺点。

随着透明质酸应用范围的不断扩大，该方法已不能满足医药和化妆品生产的需求，必将逐渐被发酵法所取代。

（二）微生物发酵法

利用微生物发酵生成透明质酸的含量和数量主要取决于三个方面：

一是菌种的筛选；

二是培养基的选配及发酵工艺的优化；

三是分离提纯。

生物发酵法具有产品不受原料资源限制、生产成本低、工艺简单等特点，是今后研究开发的方向。

1．菌种的筛选。

目前所用的菌种主要有兽疫链球菌、马疫链球菌和类马疫链球菌等『2J。

为使透明质酸不被酶所分解，提高透明质酸的产量，可在发酵培养基中添加透明质酸酶抑制剂，实际生产中更常用的方法是对原始菌种进行一定的诱变处理，以得到适应性强、生命力旺盛、透明质酸产量高的安全菌株，NTG（N一甲基一N一硝基一N一亚硝基胍）是较有效的化学诱变剂。

2．培养基的选配及发酵工艺的优化。

目前所用培养基氮源为各种肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机盐等，其中酵母浸膏最常用。

碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖，还有磷酸盐、硫酸盐等无机盐。

此外，为了获得高分子量的透明质酸，培养基中不能含有促使透明质酸降解的金属离子，如铁离子、铜离子，也不能加入自由基消

除剂。

透明质酸发酵有需氧发酵和厌氧发酵，有氧发酵一般产率高且分子量高。

在透明质酸发酵过程中，pH值一般控制在6．0～8．5范围内，低于6．0或高于8．5都会影响菌体生长，降低产率。

温度通常为37~C，在不同发酵阶段采用不同的溶氧量，也可提高透明质酸的产率。

此外，发酵液黏度可直观反映出透明质酸产率的高低，透明质酸的假塑性在高剪切速率作用下使溶液黏度下降，减轻传质的影响，高搅拌速率能显著提高透明质酸的分子量，但过高的速度会降低透明质酸的分子量，通常控制在100～800r／min之间。

发酵液中加人少量尿嘧啶、谷氨酰胺和天冬氨酸，或加入溶菌酶，也能提高透明质酸产量。

3．透明质酸的分离纯化。

分离纯化的主要目的是获得纯度较高的透明质酸，目前国内外一般以葡萄糖醛酸含量表示透明质酸的纯度，保健品及化妆品中透明质酸的葡萄糖醛酸含量为35％一45％，药用级别为42％

～48％t4J。

针对透明质酸发酵液的特性，分离纯化方法很多，在不同阶段分离纯化技术也不尽相同，但总体上可概括为如下流程：

发酵液一预处理一分离（初步纯化）一纯化一干燥一成品。

（1）预处理。

预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺，通过预处理可以杀灭透明质酸酶，减少透明质酸分子量的降低。

常用的灭菌剂包括三氯乙酸、氯仿等。

三氯乙酸可以溶解细胞上的脂类物质，使细胞破坏，从而起到灭菌和抑制酶活力的作用，氯仿和三氯乙酸的作用类似。

除菌的方法也有很多，相对于盐酸法、甲醛法。

三氯乙酸除菌法对于透明质酸的产量和质量均有提高，这是由于三氯乙酸的加入使透明质酸与蛋白质的络合有一定的降解陶。

过滤除菌法是物理过程，操作简便，效果明显，并且容易在工业化生产中应用，在发酵结束后，将发酵液加人工业乙醇得到透明质酸粗品沉淀，以20g／L的浓度溶于去离子水，加入硅藻土，充分搅拌以吸附菌体杂质，在pH4．6—4．8下过滤，滤液在pH为4．8时浊度最低，蛋白质在pH4．6时含量最低。

（2）透明质酸的分离工艺。

除去发酵液中的菌体后，需要将透明质酸分离出来，这是一个初步纯化过程。

乙醇沉淀是分离各种多糖的一种方法，可以使透明质酸有效脱水、脱色，从而提高透明质酸产品质量。

乙醇添加量一般是发酵液体积的2倍旧，如果乙醇添加量足够大，透明质酸浓度低至0．1％也可以完全沉淀。

预处理时由于发酵液黏度较高，离心或过滤前往往要对发酵液进行稀释，透明质酸常因稀释浓度低，直接采用乙醇沉淀，但这会消耗大量乙醇，因而浓缩可以减少乙醇用量。

膜技术不仅可以用于发酵液的浓缩，将其作为一种主体技术分离、提纯发酵液中的透明质酸也有一定可行性。

以膜技术为主体，采用微滤和超滤相结合的工艺，能够实现透明质酸发酵液的分离纯化。

（3）透明质酸的纯化工艺。

透明质酸的纯化主要用的是季铵盐纯化方法，氯化十六烷基吡啶（cPC）是一种季铵盐类阳离子表面活性剂，它能与黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀，而在高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起透明质酸与CPC复合物解离所需盐浓度远比其他黏多糖与CPC复合物解离所需盐浓度要低，利用此性质可达到纯化透明质酸的目的。

在进入透明质酸纯化阶段后，离子交换法往往被采用，因为离子交换层析分离条件温和，不会引起分子结构的变化，已经成为分离提纯生物大分子的有效方法。

1.3透明质酸的工艺研究进展

１.3.1菌种选育的研究

透明质酸是一种天然的高分子聚合物，在细菌和机体内有着重要的生理功能，早在1937年，Kendell等就发现链球菌可产生HA。

研究表明链球菌属的多种细菌都有荚膜，这种荚膜的主要成分就是HA，能够产生HA的链球菌属多为A群和C群，由于A群致病性强，较少用作菌种，C群致病性较弱，目前多采用此类菌进行生物发酵，现阶段多采用C群的兽疫链球菌、马疫链球菌、类马疫链球菌作为HA的生产菌。

而大多数C群菌在产生HA的同时产生溶血素和透明质酸酶，溶血素有溶解红细胞、杀死白细胞和伤害心脏的作用，透明质酸酶则会降解HA，因此，选育出荚膜大，无溶血素和HA酶的菌株则显得尤为关键，目前，应用最多的菌种选育方式为诱变育种和基因工程育种。

（1）诱变育种的研究

诱变剂主要包括物理诱变剂和化学诱变剂，现阶段用作HA菌种诱变因子主要有紫外线、亚甲基胍（NTG）、温度、60℃－γ射线和重离子等。

冯建成等采用马疫链球菌SH－０为出发菌，筛选出无溶血性和透明质酸酶的双缺陷型菌株X103，再以NTG为化学诱变剂对其诱变，最终选育出稳定性好，产高分子量HA的突变菌SH0201，使得HA相对分子量达到2.06×

106Ｄ。

邓静等采用复合诱变方式对兽疫链球菌先紫外诱变处理90s，然后微波处理100s，得到的突变菌株较原始菌株产HA由1.99ｇ／Ｌ提高到3.42ｇ／Ｌ。

吴明霞等采用恒温、变温进行诱变处理，结果表明变温诱变菌株相对于原菌株HA产量具有显著的提高，产量由原来的1.99ｇ／Ｌ提高到2.95ｇ／Ｌ。

叶倩文等采用超声波法和紫外线复合诱变处理得到突变菌株，该菌株的HA产量较原菌株HA产量由原菌株的0.79ｇ／Ｌ提高到1.41ｇ／Ｌ。

陈永浩等以马疫链球菌为出发菌株，通过紫外线和60℃－γ射线辐照诱变，得到一株无溶血性菌株NC1150，并在此基础上继续用60℃－γ射线辐照诱变得到产量较高的菌株NC168，使HA产量比菌株NC1150相对提高了101％。

魏甲乾等采用重离子和紫外诱变相结合的方法对兽疫链球菌进行诱变，使突变菌株产透明质酸能力提高了3倍多产率稳定在1.88～2.30g／Ｌ。

（2）基因工程育种的研究

近年来基因工程作为研究生命科学的重要工具，已在生物育种方面得到广泛的应用，基因工程不但可以完全突破物种间的障碍，而且还是一种能根据目的需要事先设计和控制的育种方法，目前在HA工程菌的应用中多采用大肠杆菌、乳酸乳球菌和枯草杆菌。

研究表明，has操纵子在链球菌中的表达是合成荚膜所必需的，has操纵子是由hasA、hasB和hasC三个基因组成，分别编码着HA合成酶、UDP－葡萄糖脱氢酶和UDP－葡萄糖焦磷酸化酶，只要将HA合成酶基因和UDP－葡萄糖脱氢酶基因转入宿主细胞中，在合适的培养和诱导条件下，即可产生HA合成酶和HA。

Hyun等利用大肠杆菌作为表达系统，将多沙巴斯德菌的HA合成酶基因和大肠杆菌K5的UDP－葡萄糖脱氢酶基因导入到大肠杆菌JM109中得到重组菌，在发酵摇瓶培养条件下HA含量达到0.5ｇ／Ｌ,在发酵罐中采用流加培养，HA产量大致为2.0～3.8ｇ／Ｌ。

Chien等将兽疫链球菌HA合成酶基因和马疫链球菌UDP－葡萄糖脱氢酶基因分别导入到乳酸乳球菌中，得到新的重组菌株，HA产量达到0.65ｇ／Ｌ。

Prasad等将hasA、hasB、hasC分别组合导入到乳酸乳球菌中，重组菌株含有质粒PSJR2（只含有hasA和hasB基因），通过摇瓶培养，HA的产量最高达到0.107ｇ／Ｌ，重组菌株含有质粒SJR3（含有hasA、hasB和hasC基因），HA产量达到0.234ｇ／Ｌ，而重组菌株含有所有启动子的质粒（包括hasA、hasB、hasC、hasD、hasE基因）则表现出结构不稳定性。

择优采用含有质粒SJR3的菌株进行发酵罐培养，在适宜条件下培养，HA产量达到1.8ｇ／Ｌ。

Widner等将hasA基因导入到枯草杆菌中，重组的枯草杆菌在适宜的条件下获得的HA分子量达到1.1×

106～1.2×

106Ｄ，基于枯草杆菌无毒害性和发酵过程中不产生HA酶，目前在工业化生产中常用作工程菌。

发酵工艺的研究发酵工艺是影响HA分子量和产量的重要因素，适宜的发酵工艺有利于微生物自身的生长，同时又可以使代谢最大程度地向着HA合成的方向进行，极大地提高了微生物对底物的利用效率。

因此，探索出HA较佳的发酵条件具有重大的意义。

1.4透明质酸的市场前景

（一）在化妆品方面的应用

透明质酸作用于皮肤表面，大分子透明质酸可在皮肤表面形成一层透气的薄膜，使皮肤光滑湿润，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害；

小分子透明质酸能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收、消皱增加皮肤弹性、延缓皮肤衰老等作用。

透明质酸还能促进表皮细胞的增殖和分化、清除氧自由基，可预防和修复皮肤损伤。

透明质酸的水溶液具有很高的黏度，可使水相增稠，使油相乳化后的膏体均匀细腻，具有稳定乳化作用。

因此，透明质酸已被广泛应用于膏霜、乳液、面膜、洗面奶、洗发、护发、润肤露等化妆品中。

（二）在临床方面的应用

透明质酸是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。

可用作眼科人工晶体植入手术的黏弹剂，骨性关节炎和类风湿性关节炎等关节手术的填充剂，并且在眼科、鼻科、喉科、骨科和普外科等多方面取得了可喜的成绩。

（三）在药物中的应用

透明质酸作为媒介在滴眼液中广泛应用，不仅起到了增稠的作用，还可增加药物的生物利用度，并减轻药物对眼的刺激，促进眼部创伤愈合，迅速缓解眼部不适。

由于透明质酸钠的黏度比房水高5000倍，所以1％透明质酸钠注射剂注入前房后，可加深前房，维持前房一定空间深度，其滑黏性有利于异物取出和人工晶体植入等。

另外，透明质酸钠可作为滑润剂润湿眼球表面，防止上皮干燥，常用于治疗干燥性角结膜炎（干眼病）等。

还用于预防术后粘连和促进皮肤伤口的愈合，作为构成细胞外基质和细胞问基质的主要成分。

透明质酸与其他药物反应形成的化合物对药物发挥缓释作用，可达到定向和定时释放的目的。

（四）在保健品方面的应用

透明质酸已在欧美等发达国家中广泛应用于保健食品中。

通过口服透明质酸来增加体内的含量，来补充人体内透明质酸的不足。

透明质酸通过消化、吸收，可使人精力充足，富有青春活力；

可使皮肤滋润光滑、柔软而富有弹性；

可延缓衰老，防止关节炎、动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等病症的发生。

2设计的内容和依据

2.1设计题目

年产10吨透明质酸发酵生产工艺设计

2.2设计依据

河北科技大学生物科学与工程学院生物工程系下达的2013届毕业设计任务书。

一、发酵阶段设计依据：

发酵罐1m3（或2m3、5m3、10m3）

发酵单位5g／L发酵液

发酵周期36h

辅助时间8h

装料系数0.70

种子罐周期12h

发酵过程补料无

蒸发损失接种后体积的5％

种子罐装料系数0.70

种子罐损失（以灭菌完成体积为准10%

接种量（以灭菌完成体积为准）10%

透明质酸发酵生产使用的种子和发酵培养基

种子培养基：

葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母粉1%，MgSO4·

7H2O0.04%，K2HPO40.2%，调pH7.4，115℃灭菌20min。

发酵培养基：

葡萄糖4%，蛋白胨1%，酵母粉1%，MgSO4·

7H2O0.04%，K2HPO40.2%，调pH7.4，115℃灭菌20min。

二、透明质酸提取阶段设计依据：

发酵液体积1m3（或2m3、5m3、10m3）