进出口食物中金黄色葡萄球菌计数查验方式全自动MPN法编制说明Word格式.docx
《进出口食物中金黄色葡萄球菌计数查验方式全自动MPN法编制说明Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《进出口食物中金黄色葡萄球菌计数查验方式全自动MPN法编制说明Word格式.docx（33页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
4、植物检疫；
5、纺织产品检验；
6、轻工产品检验；
7、机电产品检验；
8、化工、矿产品和金属材料检验；
9、管理；
10、鉴定；
11包装及危险化学品
标准体系表代码
调整情况
无
2背景情况
目的、意义
金黄色葡萄球菌（StaphyloccocusaureusRosenbach）是人类的一种重要，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），可引起多种严重感染。
有“嗜肉菌"
的别称。
金黄色葡萄球菌在中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。
因而，食品受其污染的机会很多。
近年来，报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于。
金黄色葡萄球菌是个世界性卫生难题，在由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的，占整个的33%，则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。
一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：
食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成；
食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；
熟食制品包装不密封，运输过程中受到污染。
所以，很多国家将金黄色葡萄球菌检测作为微生物污染状况的监测指标。
目前，国际标准化组织（ISO）、美国食品药品管理局（FDA）、美国化学家分析协会（AOAC）、北欧食品分析委员会标准（NMKL）和中国国家标准（GB）等国际国内标准化组织或权威机构都发布了很多关于金黄色葡萄球菌计数检验的方法，但多为传统的平板计数法、MPN法等，使用这些方法检测时都比较费时费力，需要大量人工进行器皿的清洗、培养基配制等实验准备工作，检测结果需要操作人员依据各自经验进行计数报告，无法避免因人员经验导致的结果误差。
TEMPO全自动微生物定量分析仪是全世界第一台全自动的以MPN原理对各种细菌进行计数检测的仪器，减少了大量的实验准备工作，也大大减少对操作人员的需求和对人员的经验要求，从而提高对食品中金黄色葡萄球菌计数检测的工作效率和准确性。
该标准的制定将完善国内针对进出口食品中金黄色葡萄球菌计数检验方法，确保检验步骤标准化、检验结果可追溯。
符合《出入境检验检疫行业标准应急快速制（修）订程序的管理规定》中的要求。
与国内外相关标准、文献的关系
本标准参考了法国标准协会（AFNOR）和美国化学家分析协会（AOAC）对TEMPOSTA方法的评估试验报告（见参考文献1和2）。
在本标准方法验证过程中，以水产品的验证数据《微生物学通报》发表文章《TEMPO/STA法在水产品金黄色葡萄球菌计数检测中的应用》（2010,Vol37,）。
3编制过程
准备阶段（可选项）
分工情况
辽宁局：
负责标准文本起草、拟定验证方案、负责水产类、乳及乳制品和杂项等食品的方法验证工作，汇总资料，组织试验时间技术验证、征求意见等。
舟山局：
负责禽、肉制品和水果、蔬菜类制品的方法验证工作，并提供相关资料，协助完成标准制定中相关事宜。
标准草案编写情况
本标准结合了TEMPO全自动定量分析仪操作说明和金黄色葡萄球菌STA试剂盒方法，确定标准草案主要内容：
培养基和试剂、设备和材料、样品制备、操作步骤及报告方法，并提供仪器日常维护和质量控制的方法作为资料性附录。
选择5类食品进行自然或人工污染样品进行实验室内方法验证，选择5家独立实验室进行实验室间方法验证。
按照GB/T《标准化工作导则第1部分：
标准的结构和编写》要求，编写标准草案。
征求意见情况（适用于送审稿）
审定情况
（适用于报批稿）
预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）
4主要技术内容的确定
1.国际权威组织AFNOR、AOAC关于金黄色葡萄球菌TEMPO方法的评价报告
TEMPOSTA试剂盒及方法通过了法国AFNOR、美国AOAC两家国际权威组织的认证。
AFNOR按照“ISO16140Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Protocolforthevalidationofalternativemethods”,选用ISO6888-2金黄色葡萄球菌计数方法作为参照方法，对TEMPOSTA试剂盒的线性、精确性、选择性和特异性等参数进行全面评价。
ANFOR选择性和特异性测试中：
30株凝固酶阳性的葡萄球菌，1株在TEMPOSTA方法中未检出，在TEMPOSTA方法和ISO6888-2方法中均未检出。
24株凝固酶为阴性的葡萄球菌，不存在交叉反应。
AOAC按照“AOACInternationalMethodsCommitteeGuidelinesforValidationofQualitativeandQuantitativeFoodMicrobiologicalOfficialMethodsofAnalysis-2002”,选用AOACOMA方法进行对比，将两种方法的结果取LOG10，在95%置信度下分析标准偏差与相关性。
经分析，结果相关性为98%，TEMPOSTA方法与参考方法无偏差。
AFNOR和AOAC的评估试验报告见参考文献1和2。
从两个权威机构发布的评估试验报告中，表明TEMPOSTA方法对金黄色葡萄球菌具有良好的选择性，对非金黄色葡萄球菌具有良好的特异性。
2.方法原理
TEMPOSTA方法是对食品中金黄色葡萄球菌计数的全自动检测方法，每个TEMPOSTA测试包括一瓶选择性脱水培养基和一张3梯度16平行的48孔卡片，依据MPN方法进行全自动检测。
培养基接种待测样本，通过TEMPO充填器被转种到48孔卡片中。
在充填过程中，TEMPO充填器将卡片封口以避免在随后的处理过程中样品受到污染。
培养基含pH荧光指示剂，当pH值中性时可产生被TEMPO读数器检测到的荧光信号。
培养期间，卡片中有金黄色葡萄球菌存在就会分解培养基，pH值下降，荧光信号减弱。
培养结束后，将卡片放入TEMPO读数器，仪器自动读取荧光结果。
按照MPN方法的原理，TEMPO系统根据阳性孔的数目和大小来推算出原始样本中的金黄色葡萄球菌数。
3.验证试验
验证方法介绍
TEMPOSTA方法操作步骤按本标准制定的程序，培养温度及时间为：
36℃±
1℃培养24h～27h。
AFNOR评估中选择的参照方法是ISO6888-2，选用Baird-Parker平板计数法，AOACOMA为传统的MPN方法。
本标准验证采用我国现行标准GB《食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》，第二法Baird-Parker平板计数法。
验证方案
3.2.1室内验证
选择5类自然或人工污染食品（a.禽、肉制品，b.水果与蔬菜制品，c.水产品，d.乳及乳制品，e.杂项），每类食品选择不少于10种样品，每种样品为3个梯度的污染水平。
进行两种方法的比较，选用方差分析或简化的以LOG差值<
1对方法进行评价。
3.2.2室间验证
选择5家独立的实验室，选择5类自然或人工污染食品（a.禽、肉制品，b.水果与蔬菜制品，c.水产品，d.乳及乳制品，e.杂项），每类食品选择10种样品，每种样品为3个梯度的污染水平。
3.2.3人工污染样品制备
在确认无金黄色葡萄球菌污染的食品中添加金黄色葡萄球菌ATCC25923菌悬液，制备
成三个水平的人工污染样品（高浓度：
104cfu/mL、中浓度：
103cfu/mL、低浓度：
102cfu/mL）。
3.2.4样品检测
制备好的样品同时采用TEMPOSTA方法与GB方法进行检测。
验证结果
3.3.1室内验证结果
3.3.1.1人工污染样品的验证结果
按照验证方案开展的人工污染样品验证结果见下表：
第1类：
禽、肉制品
测试样品
污染水平
TEMPO/STAlog值
GBlog值
差值绝对值
猪肉
102（低）
103（中）
104（高）
猪舌
牛肉
香肠
腊肉
酱牛肉
鸭肉
烤鸡
冻鸡肉
冻鸭肉
第2类：
水果与蔬菜制品
土豆条
玉米泥
蔬菜沙拉
水果沙拉
泡菜
藕
苹果汁
菜干
草莓
香蕉
第3类：
水产品
冻鳕鱼片
冻红鱼片
冻石斑鱼片
冻马哈鱼片
冻鲽鱼籽
盐渍真鳕鱼片
冻煮杂色蛤
单冻扇贝柱
冻煮虾蛄肉
冻平鮋片
第4类：
乳及乳制品
低乳糖奶
奶片
较大婴儿奶粉
活菌型乳酸菌乳饮料
全脂再制干酪
高钙奶
纯牛奶
奶糖
炼乳
高蛋白奶米粉
第5类：
杂项
果冻
燕麦片
蛋糕
蛋挞
沙拉酱
三明治
龟苓膏
汤圆
飞饼
饼干
3.3.1.2自然样品的验证结果
选择自然样品同时用本标准方法与基准方法测试，结果如下：
第1类：
GBlog值
饺子
猪舌头
猪心
贡丸
猪肝
烤鸡腿
盐水鸡
烤鸭肉
鸡翅
鸡肝
鹅肝
冻鸡翅
鹅血
鸡蛋
玉米
梨
洋姜
青瓜
哈密瓜
葡萄
香瓜
酱娃娃菜
白菜
芹菜
茄子
黄豆芽
咸菜
番茄
西瓜
葱
蘑菇
青菜
差值
冻鲽鱼片
冻真鳕鱼片
冻粉色鲑鱼段
盐渍鳕鱼片
冻鲽鱼卷
冻煮虾夷贝肉
冻柳叶鱼
冻小虾
原味豆奶粉
儿童成长高钙奶粉
加锌铁钙豆奶粉
甜筒
早餐涂抹奶酪
核桃牛奶
配制型含乳饮料
干吃奶片
低脂调制奶
婴儿配方奶粉
含乳饮料
调制乳
切片面包
火锅调料（芝麻酱）
烧饼
山楂片
浓汤宝
火锅调料（沙茶酱）
薯条
地瓜干
豆干
调味菜
油茶面
香蕉片
三明治（花生酱）
棒棒冰
4.结果统计与结论
人工污染样品的验证结果统计
用TEMPOSTA法与GB所规定的金黄色葡萄球菌计数检验方法同时对5种类各10个食品进行检测，统计结果如下：
样品种类
样品数
符合a的样品数
超出计数范围但结果一致的样品数
不符合b的样品数
符合率（%）
10
9
/
1
共计
50
48
2
a:
∣Log10EC-Log10SN∣<
1为“符合”b:
∣Log10EC-Log10SN∣>
1为“不符合
自然样品的验证结果统计
用TEMPOSTA法与GB所规定的金黄色葡萄球菌计数检验方法同时对5种类各105个食品进行检测，统计结果如下：
23
22
20
19
18
3
14
21
5
16
105
12
90
结论
室内验证的结果表明TEMPOSTA法与GB法符合率较高，为%，且具有简便、快速、高效、人为误差较小的特点。
但部分样品，TEMPOSTA结果与基准方法结果有差异。
分析其原因主要是，样品中可能含有对荧光有影响的物质。
5验证情况（适用于方法类标准）
验证单位情况
验证单位
验证人员
验证时间
龙口出入境检验检疫局综合技术服务中心
吕斐、苏远科
2011年08月23日
辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心东港分中心
施东福、丁健、孙秋颖
2011年8月12日
深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心
吕敬章、黄李华、刘慧玲
2011年8月25日
福建出入境检验检疫局
郑晶
2011年8月17日
福建疾病预防控制中心
马群飞
2011年8月21日
验证过程
本方法的室间验证试验选择了5家独立检测机构：
龙口出入境检验检疫局综合技术服务中心、辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心东港分中心、深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心、福建出入境检验检疫局和福建疾病预防控制中心。
5家检测机构按照《进出口食品中金黄色葡萄球菌计数检验方法全自动MPN法》（征求意见稿）分别对5类不同污染程度的食品样品进行金黄色葡萄球菌计数检测，同时用基准方法进行检测，两种方法的计数结果取LOG对数值，并计算LOG差值，如LOG差值小于1，则表明两种方法无显著差异。
验证数据分析
表1室间验证结果
logTEMPO值
log基准方法值
第1类
禽、肉
升级会员 