SDSPAGE电泳测定蛋白质相对分子质量Word文档格式.docx
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式中：
Mr为蛋白质的分子量；
K为常数；
b为斜率；
mR为相对迁移率。
在条件一定时，b和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
仪器、原料和试剂
仪器：
垂直板型电泳槽；
直流稳压电源；
50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；
烧杯；
吸量管；
常头滴管等。
原料：
低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·
ml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
试剂：
（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:
取1mol/L盐酸48mL，Tris36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:
取1mol/L盐酸48mL,Tris5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（3）30%分离胶贮液：
配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。
（4）10%浓缩胶贮液：
称Acr10g及Bis0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。
（5）10%SDS溶液：
SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。
（6）1%TEMED；
（7）10%过硫酸铵（AP）：
现用现配。
（8）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:
称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,SDS1.0g,用无离子水溶解后定容至1L。
（9）样品溶解液：
取SDS100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。
用来溶解标准蛋白质及待测固体。
（10）染色液：
0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。
（11）脱色液：
75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。
实验步骤
1．安装夹心式垂直板电泳槽：
目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。
同学们可根据具体不同型号要求进行操作。
主要注意：
安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；
勿用手接触灌胶面的玻璃。
2．配胶：
根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。
本实验采用SDS-PAGE不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。
试剂名称
配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml
配制10ml浓缩胶所需试剂用量
5%
7.5%
10%
15%
3%
分离胶贮液
（30%Acr-0.8%Bis）
3.33
5.00
6.66
10.00
-
分离胶缓冲液
（pH8.9Tris-HCl）
2.50
浓缩胶贮液
（10%Acr-0.5%Bis）
3.0
浓缩胶缓冲液
（pH6.7Tris-HCl）
1.25
10%SDS
0.20
0.20
0.10
1%TEMED
2.00
重蒸馏水
11.87
10.20
8.54
5.20
4.60
混匀后，置真空干燥器中，抽气10min
10%AP
0.10
0.05
3．制备凝胶板：
（1）分离胶制备：
按表配制20ml10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。
约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。
倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。
（2）浓缩胶的制备：
按表配制10ml3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。
约30min后凝胶聚合，再放置20—30min。
待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。
4．样品处理及加样
各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。
处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。
一般加样体积为10－15μL（即2－10μg蛋白质）。
如样品较稀，可增加加样体积。
用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
5．电泳
将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。
待样品进入分离较时，将电流调至20－30mA。
当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。
拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
6．染色及脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。
计算
1.相对迁移率mR=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）
2.以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
注意事项
1.
不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。
包括：
电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。
例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。
因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。
2．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。
因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。
为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。
思考题
1．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳原理上有何不同？
2.
用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇？
3．用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量，为什么有时和凝胶层析法所得结果有所不同？
是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量？
为什么？
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