细胞培养与细胞生物学常用技术Word文档格式.docx

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肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

1、配制1.2%和0.7%的低熔点琼脂糖，高压灭菌后置于42℃水浴锅（或者恒温温箱）中，使其保持融化状态；

2、配制2xDMEM培养基（含20%FBS、2x抗生素），37℃预热；

3、将1.2%的低熔点琼脂糖胶与2xDMED培养基等体积混合，将混合液加入到6孔板中，每孔1.5mL，轻轻混匀，避免产生气泡，室温放置待其凝固；

4、取对数生长期的细胞，胰酶消化后尽量吹散细胞，制成单细胞悬液，取出10μL，细胞悬液进行细胞计数，用无血清培养基稀释细胞至1x104个/mL；

5、待下层胶完全凝固后，各取1.5mL的0.7%琼脂糖胶与2x培养基进行等体积混合，加入300μL细胞悬液，充分混匀后入6孔板中，每孔1mL（即1000个细胞/孔），每种细胞设置3个平行孔；

6、将6孔板置于CO2培养箱中孵育培养2-3周后，每孔加入1mL0.1%结晶紫染色，室温染色10min，再用清水洗30min，镜下拍照，计数并分析克隆形成情况。

实验二细胞划痕愈合

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。

细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。

胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫应答、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。

细胞划痕愈合实验（woundhealing）简称划痕实验，是最早用来研究细胞迁移的体外实验，操作简单，经济实惠，因而被广泛应用。

细胞划痕愈合的操作过程十分简单，基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。

具体过程为：

当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”；

然后置于显微镜下连续拍照，记录划痕边缘的细胞逐渐进入空白区域，即“划痕”愈合的过程，最后根据“划痕”愈合的速率反映细胞迁移的速率。

1、仪器：

CO2培养箱、活细胞工作站、超净工作台、酒精灯；

2、试剂及耗材：

DMEM培养基、胎牛血清、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、30mm直径细胞培养皿、尺子、记号笔；

1、培养皿接种细胞前，先用直尺测量，并在培养皿背面做“横线”标记，大约每隔0.5～1.0cm一条，一共5条线；

2、取处于指数生长的细胞，胰酶消化后收集细胞沉淀，细胞计数后稀释至2.5x105个/mL；

3、取背面做好标记的培养皿（直径30mm），每皿接种2mL细胞，置于培养箱培养34h；

4、取出细胞培养皿，用10μL枪头比着直尺，垂直于底面的横线划痕；

5、加入1mLPBS缓冲液，清洗细胞3次，洗去划痕产生的细胞碎片；

6、加入2mL无血清培养基，置于活细胞工作站下拍照24h，每小时拍一张照片；

7、根据收集图片数据分析实验结果，计数细胞迁移率。

迁移率=【（T0时划痕宽度值-Tt时划痕宽度值）/T0时划痕宽度值】x100%

实验三细胞活力检测

最常用的细胞活力检测方法为噻唑蓝比色法（MTT法）。

MTT全称为3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，汉语化学名为3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。

活细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶可以将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，但死细胞没有此功能，因此结晶形成的量与活细胞数成正比。

DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。

由于该方法灵敏度较高，而且相对比较经济，因此广泛应用于药物筛选等细胞毒性检测领域。

CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、多功能酶标仪；

细胞培养基、胎牛血清、MTT（5mg/mL）、DMSO、75%乙醇、PBS溶液、顺铂母液

一、细胞接种

1、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，吸弃培养基，PBS洗涤2次，胰酶消化后，加入培养基重悬细胞并转移至离心管中；

2、800rpm离心2min，弃上清；

3、加入3～5mL新鲜培养基重悬细胞（以25cm2培养瓶为例），吸取10μL细胞悬液，滴加至血球计数板上进行细胞计数；

4、根据细胞计数结果，将细胞浓度稀释至4x104个/mL；

5、将细胞悬液按100μL/孔加至96孔细胞培养板；

6、将96孔板置于CO2培养箱中孵育培养过夜。

二、细胞荷药

1、用新鲜培养基将5mM顺铂母液的药物浓度稀释至15μM；

2、从CO2培养箱中取出96孔板，吸弃培养基，实验组更换为上述含药物的新鲜培养基，对照组更换为新鲜培养基；

3、将96孔板置于CO2培养箱中继续孵育培养24h。

三、MTT法检测

1、从CO2培养箱中取出96孔板，吸弃培养基，每孔加入90μL新鲜培养基及10μL5mg/mLMTT；

2、将96孔板置于CO2培养箱中继续孵育培养4h；

3、吸弃培养基，每孔加入100μLDMSO，震荡混匀10min；

4、用酶标仪测定490nm处的吸光值（A490），计算细胞活力。

实验四细胞免疫荧光

免疫细胞化学（immunohistochemistry），是利用抗原抗体间特异性结合的原理，同时借助特殊的标记技术，实现对细胞内目的抗原或抗体进行定位、定性或定量检测的一种技术。

它不仅特异性强、灵敏度高，而且克服了传统免疫学检测技术只能定性和定量，而不能定位的缺点，可以实现定性定量的同时对目的蛋白进行精确定位，因此又被称为原位免疫检测技术。

也正由于具备这些优势，免疫细胞化学技术已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等诸多领域中得以被广泛应用。

免疫细胞化学技术有多种染色方式，根据标记物的种类，分为免疫荧光法、免疫酶标法、免疫铁蛋白法及免疫胶体金发等。

其中，免疫荧光法结合激光共聚焦扫描显微镜拍照技术，大大提高了检测分辨率，可以更为精确地检测抗原的细胞定位及分布。

目前可选用的荧光素较多，其中较为成熟的荧光素标记物包括异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodaminisothiocyanate，TRITC）、四乙基罗丹明（rhodamine，RB200）等，更有利于实现同时对两种或多种抗原进行检测，即双染和多染技术。

另外，免疫荧光可以对活细胞进行染色，在流式细胞术（flowcytomitry，FCW）方面有更多的应用，因而成为最为常用的免疫细胞化学技术之一。

免疫荧光技术是先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

在细胞中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，受激发光的照射后，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态的过程中可以发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。

根据荧光素标记的位置，可以分为直接法与间接法。

直接法是最早的标记方法，是利用荧光素直接标记待测蛋白第一抗体的标记方法，这种方法特异性高，但灵敏度较低，而且每种抗体均需要单独标记，十分不便且成本相对较高，因此逐渐被其他方法所替代；

间接法是对直接法的改进，它不再标记直接与抗原结合的特异性一抗，而是标记与一抗结合的二抗，由于与一抗结合的二抗分子往往不是一个，因此间接法可以大大提高检测的灵敏度，与直接法相比，荧光亮度可增强3-4倍。

除灵敏度高外，间接法所需要的种属间接荧光抗体，可以适用于同一种属产生的多种第一抗体的标记显示，大大降低了检测成本，因此成为现在最广泛应用的免疫荧光技术之一。

CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、正置荧光显微镜、高压灭菌锅；

DMEM培养基、胎牛血清、无水乙醇、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、4%多聚甲醛、P53一抗、FITC荧光二抗、抗荧光衰减封片剂、TritonX-100；

一、准备工作

1、切片处理：

将盖玻片置于浓酸浸泡过夜，自来水冲洗20遍，蒸馏水清洗5遍，高压灭菌，烘干备用；

2、细胞悬液制备：

胰酶消化HepG2细胞，收集细胞沉淀，培养基重悬，制成单细胞悬液，计数后稀释至2x105个/mL备用。

二、细胞爬片

1、在6孔板孔中央滴加100μL培养基，每孔放入一张经过处理的盖玻片，使其恰好覆盖在孔内培养基上；

2、每孔缓慢逐滴加入2mL稀释后的细胞悬液，轻柔混匀；

3、将6孔板置于CO2孵箱中，培养过夜。

三、免疫荧光1、取出6孔板，弃掉孔内培养基，PBS轻柔清洗3次，每次3min；

2、每孔加入1mL预冷的4%多聚甲醛，4℃固定20min；

3、PBS清洗3次，每次3min；

4、每孔加入1mL含0.2%TritonX-100的PBS，冰上静置10min；

5、PBS清洗3次，每次3min；

6、每孔加入1mL含1%BSA的PBS，室温封闭1h；

7、将P53一抗以1:

100的比例稀释后，取出100μL滴加在封口膜上，从培养孔中取出盖玻片，用吸水纸吸去背面及细胞面边缘处的液体后，轻轻放在封口膜上，细胞面与抗体均匀接触，4℃孵育过夜；

8、取下盖玻片，置于6孔板相应孔中，PBS清洗3次，每次3min；

9、滴加荧光素二抗，37℃孵育30min（注意避光操作）；

10、PBS清洗3次，每次3min；

11、每孔加入500μLDAPI染色液，室温染色5min；

12、PBS清洗3次，每次3min；

13、取一张洁净载玻片，中心位置滴加50μL抗荧光淬灭封片剂，从6孔板中取出盖玻片，控干液体，贴有细胞的一面朝下，放置在封片液上，尽量避免气泡；

14、显微镜下观察、拍照。

实验五细胞转染

细胞转染是将外源DNA或RNA导入真核细胞，用来研究真核细胞基因功能、基因表达调控和蛋白质表达的专门技术。

根据实验目的，细胞转染技术分为两大类吗，分别为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后，不整合到宿主染色体上，以游离的形式存在，一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，因此可产生高水平的表达。

但由于无法复制，表达时间有限，仅持续2-4天，最终在细胞分裂过程中逐渐丢失。

稳定转染则是指外源基因整合到宿主细胞染色体上，成为宿主细胞基因组的一部分，可以复制并稳定地遗传给子代细胞，形成稳定转染的细胞株。

因此，瞬时转染一般用于短期研究，例如研究基于或基于产物的短期表达，基于敲出或RNA介导的基于沉默，以及蛋白质小规模表达等；

稳定转染则用于需要基因长期持续的表达情况，例如大规模蛋白表达、长期药理学研究、基因治疗研究和长期遗传调控机制研究等。

相较于瞬时转染，稳定转染所需要时间更长，成本更高。

细胞转染过程中，仅有部分细胞可以成功转入外源基因，这部分细胞占总细胞的百分比被称为转染效率。

影响转染效率的因素很多，其中包括：

细胞培养基、细胞状态、细胞密度、DNA质量、血清含量、抗生素、DNA质量（μg）/转染试剂体积（μL）比、转染方法等。

一般情况下，处于指数生长中后期的细胞，生长状态越良好越容易转染；

细胞密度最好控制在70%-90%之间；

血清的存在会影响DNA-转染复合物的形成；

转染过程中使用抗生素可能增加细胞的死亡率；

推荐DNA质量（μg）/转染试剂体积（μL）比为1:

2～1:

3；

DNA质量对转染效率影响非常大，DNA不纯，如带少量的盐离子、蛋白、脂多糖、内毒素等都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行；

转染技术较多但各有利弊，如DEAE右旋糖苷法、磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法等。

目前最为常用的方法为脂质体法、病毒介导法及电穿孔法。

脂质体法是利用带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，沉积于细胞表面，通过内吞作用进入细胞，这种方法几乎适用于所以细胞，转染效率高，适用于稳定转染尤其适用于一些难转染的细胞，例如原代细胞、活体细胞等，但需要考虑安全因素；

电穿孔法利用短暂的高电场电脉冲处理细胞，破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔进入细胞，可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪，而且此方法对细胞损伤很大，细胞的死亡率高，每次转染需要大量的细胞和DNA。

本实验采用多价阳离子脂质体介导的瞬时转染方法。

CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、离心机、血球计数板、计数器；

细胞培养基、胎牛血清、Lipofectamine®

2000、75%乙醇、PBS缓冲液、0.25%胰酶溶液、质粒（pcDNA3.1（-）空载体、pcDNA3.1（-）-P53重组载体、pEGFP-C1空载体）；

4、根据细胞计数结果，将细胞浓度稀释至2x105个/mL；

5、按2mL/孔将细胞悬液加入至6孔细胞培养板；

6、将6孔板置于CO2培养箱中孵育培养过夜。

二、细胞转染

1、配制A液：

2.5μg质粒DNA加入到100μLOpti-EME培养基（或无血清培养基）配成A液，上下颠倒混匀，孵育5min；

2、配制B液：

将7.5μL的Lipofectamine®

2000加至100μLOpti-EME培养基（或无血清培养基）配成B液，上下颠倒混匀，孵育5min；

3、配制C液：

将A液加入B液，充分混匀为C液，室温孵育15min；

4、在孵育过程中，取出过夜培养于6孔板的HepG2细胞，弃掉培养基，每孔加入2mL新鲜培养基（不含双抗）；

5、孵育结束后，每孔加入500μLC液，逐滴多位置加入，轻轻摇动6孔板；

6、置37℃培养箱孵育；

7、孵育6小时后，更换新鲜培养基（不含双抗）。

实验六细胞总RNA提取

利用高浓度强变性剂异硫氰酸胍迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核中的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子解离。

同时，高浓度异硫氰酸胍和β-巯基乙醇还可以使细胞内的各种RNA酶失活，保护释放出的RNA不被降解。

细胞裂解后的裂解溶液内除RNA以外，还有核DNA、蛋白质以及细胞残片，通过氯仿等有机溶剂抽提、离心，可将RNA与其它细胞组份分离开来，得到纯化的总RNA。

TRIzol是一种抽提总RNA的复合试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破坏细胞，抑制细胞释放出RNA酶，适用于多种组织和细胞总RNA的提取。

1、试剂：

TRIzol、RNase-free水、氯仿、异丙醇、75%乙醇、PBS缓冲液；

2、细胞株：

1、操作人员：

戴口罩、手套；

2、工作区域：

实验室事先经紫外线照射过夜，实验开始前用75%乙醇擦拭台面。

实验过程中不要随意接触非实验物品并尽量减少走动；

3、实验器具：

用75%乙醇擦拭移液器和EP管架；

低温离心机预冷；

-20℃预冷的75%乙醇。

二、总RNA的提取

1、从CO2培养箱中取出实验五转染过的6孔板，倒置显微镜下观察细胞生长状态；

2、吸弃培养基，PBS洗涤2次；

3、按1mL/孔加入TRIzol试剂，使其充分接触细胞，室温静置2min；

4、用移液器轻轻吹起细胞，将细胞悬液转移至无RNase的1.5mLEP管中；

5、按0.2mL/1mLTRIzol比例加入氯仿，盖紧EP管盖，用手剧烈震荡混匀，直至溶液呈乳白色，无分相现象；

6、室温静置5min，4℃12000rpm离心15min（离心过程中，准备新的1.5mLEP管）；

7、从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分为三层，上层是透明的水相，RNA溶解在此层中；

半固体状的中间层，此层含有DNA；

下层为粉红色的有机相，蛋白质、多糖等物质溶解在此层中；

8、将上层溶液小心转移至新的EP管中，每个EP管中约能取出400μL（要求谨慎操作，切勿吸到中间层）；

9、往水相中加入等体积异丙醇（纯化RNA），上下颠倒EP管，充分混匀；

10、室温静置10min后，4℃12000rpm离心15min；

11、小心弃去上清，白色沉淀即为总RNA；

向含有沉淀的EP管中加入1mL-20℃预冷的75%乙醇，轻轻上下颠倒，洗涤沉淀；

12、4℃12000rpm离心5min；

13、用移液器除去上清，尽量不要接触沉淀；

14、将EP管再次瞬时离心，用移液器将残存在EP管底部的少量液体除去；

15、打开EP管盖，室温放置5min干燥（时间太长，RNA不易溶解）；

16、用30μLRNase-free水溶解沉淀；

17、RNA溶液保存在-80℃冰箱中；

三、RNA质量检测

1、吸光度测定方法

①原理：

核酸在260nm附近有强吸收，蛋白质在280nm附近有强吸收，因此常利用此性质，使用紫外分光光度计测定核酸溶液在260nm和280nm下的吸光度，根据A260的吸光度，计算提取的核酸收量，根据A260/A280的比值来评价提取的核酸纯度。

理想的RNA纯度A260/A280应在1.8～2.2范围内；

②步骤：

按照1:

50的比例，用RNase-free水稀释RNA样品；

利用分光光度计测定260nm、280nm及320nm波长下的光密度，计算其A260/A280的比值和RNA浓度；

RNA浓度计算公式如下：

RNA浓度（μg/μL）=（A260-A320）x稀释倍数x0.04；

2、凝胶电泳方法

根据1%琼脂糖凝胶电泳（总RNA上样量1000ng左右）结果，对提取的总RNA进行RNA完整性以及是否有基因组DNA污染的评价；

如果可以清晰观察到两条rRNA条带（真核生物：

28S和18S；

原核生物：

23S和16S），且其浓度比值大约为2:

1～1:

1，则RNA未降解，否则有部分降解；

若观察到smear，则RNA已发生完全降解；

如果观察到大于28S或23S的条带，则样品可能有基因组污染，这时可以考虑使用DNaseⅠ处理。

实验七逆转录反应

RNA自身不能作为PCR反应的模板，所以必须先将其逆转录为cDNA。

逆转录酶可以用mRNA作为模板产生与之互补而不含内含子的cDNA，后者可用于构建cDNA文库。

此时可应用两种引物，一种是特异性互补于mRNA3’末端的寡聚腺苷酸的oligodT引物，另一种是随机核苷酸的寡聚体。

将PCR与逆转录结合应用，可以进行目的基因的特异性扩增，检测组织或细胞中mRNA的表达水平。

试剂：

PrimerScriptRTreagent；

1、总RNA溶液稀释至200ng/μL；

2、配制逆转录反应混合液（要求冰上操作），反应体系如下：

试剂体积（μL）

RNase-freeddH2O1.5μL

5xPrimerScriptBuffer2.0μL

OligodTPrimer（50μM）0.5μL

Random6mers（100μM）0.5μL

PrimerScriptRTEnzymeMixⅠ0.5μL

TotalRNA（200ng/μL）5.0μL

总体积10.0μL

注：

10μL逆转录体系中加入1000ng的TotalRNA

3、逆转录反应在PCR仪中进行，反应条件如下：

37℃15min（逆转录反应）

85℃5sec（加热使逆转录酶失活）

4℃Hold

4、反应结束后，将cDNA溶液放置于4℃保存（长期保存需置于-20℃）

实验八RealTimePCR

利用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA，然后以cDNA为模板，通过PCR反应扩增目的片段。

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得可见，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法即荧光定量RT-PCR技术。

实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。

前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

本实验就是利用在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreenⅠ荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

通过实时监测荧光信号的变化，根据荧光信号的强度与体系中模板DNA的量成正比，从而推测待测样品中模板的含量。

荧光嵌合检测法原理图

基线：

反映荧光明显增加之前的背景荧光值，一般默认为3-15个循环的信号值；

阈值：

在PCR扩增曲线的指数增长区域内适当的位置上设定的荧光检出界限；

Ct值：

在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号；

MltraSYBRMixture

2、引物：

基因

引物序列

产物长度

β-actin

F：

CCGTCTTCCCCTCCATCG

155bp

R：

GTCCCAGTTGGTGACGATGC

P53

TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA

179bp

CCCTATCT