版高考生物复习第1讲基因工程教学案苏教版选修3Word格式.docx
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T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键
（3）载体
①种类：
质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点
携带外源DNA片段进入受体细胞。
[思考回答]
1．原核生物中限制酶为什么不切割自身的DNA?
提示：
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰等。
2．图甲表示EcoRⅠ限制酶及DNA连接酶的作用示意图，图乙表示SmaⅠ限制酶的作用示意图。
请据图回答问题：
（1）请写出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列以及切割位点。
EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；
SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
（2）限制酶和DNA连接酶的作用部位相同吗？
DNA连接酶起作用时，是否需要模板？
相同，都是磷酸二酯键。
不需要模板。
1．基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题
（1）获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶（也可使用能切出相同末端的不同限制酶），目的是产生相同的黏性末端或平末端。
（2）获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。
（3）限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。
（4）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。
2．限制酶和DNA连接酶的关系
（1）限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
（2）限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
（3）DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．载体
（1）条件与目的
条件
目的
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
（2）作用
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
◎考法1 考查限制酶、DNA连接酶等酶的作用
[解题指导]确定选择限制酶种类的方法
1．根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
（2）不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
（3）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。
2．根据质粒的特点确定限制酶的种类
（1）所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
（2）质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；
如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
1．（2016·
全国卷Ⅲ）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。
图（a）
图（b）
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。
这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是
图（c）
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有___________和______________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。
解析：
（1）由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是
，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图（b）所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。
（2）在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。
图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。
（3）常见的DNA连接酶有E·
coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
答案：
（1）Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
（2）甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
（3）E·
coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
2．下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。
请回答下列问题：
图1 图2
（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。
为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________。
（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，对于该部位，这两种酶________（填“都能”“都不能”或“只有一种能”）切开。
（4）若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
（1）选择的限制酶应在目的基因两端且在质粒中存在识别位点，故可以用来切割的限制酶为BclⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和Sau3AⅠ，但由于BamHⅠ和Sau3AⅠ可能使质粒中的启动子丢失或破坏抗性基因，所以应选用BclⅠ、HindⅢ两种限制酶切割。
酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。
为了扩增重组质粒，需将其转入感受态的大肠杆菌中，使其增殖。
（2）根据质粒上抗性基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。
平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物需要与单链两端相应互补序列结合，故所用引物组成是图2中的引物甲和引物丙。
（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端和BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为
，由于两种酶均不能识别该部位的碱基对序列，所用两种酶都不能切开该部位。
（4）根据BclⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点，Sau3AⅠ在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3AⅠ切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
（1）BclⅠ和HindⅢ DNA连接 感受
（2）四环素 引物甲和引物丙
（3）
都不能 （4）7
◎考法2 考查载体的作用及特点等
3．（2016·
全国卷Ⅰ）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。
有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。
结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。
被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________________（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________；
并且________________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是_________________________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。
（1）质粒作为载体，应具备的基本条件有：
有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中；
在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；
有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等等。
（2）在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。
含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。
若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。
（3）某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
（1）能自我复制、具有标记基因、具有一至多个限制酶切割位点（答出两点即可）
（2）二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 （3）受体细胞
考点二|基因工程的基本操作及其应用
1．基因工程的基本程序
（1）目的基因的获取
①从基因文库中获取
②人工合成
③利用PCR技术扩增
（2）基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成
（3）将目的基因导入受体细胞
①转化含义：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。
②转化方法
生物类型
植物
动物
微生物
受体细胞
体细胞
受精卵
大肠杆菌或酵母菌等
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射法
感受态细胞法
（4）目的基因的检测与鉴定
方法
检测或鉴定目的
水平
DNA分子杂交技术
检测目的基因的有无
分子水平
分子杂交技术
目的基因是否转录
抗原—抗体杂交
目的基因是否翻译
抗虫或抗病接种实验
是否具有抗虫抗病特性
个体水平
2.PCR技术
（1）原理：
DNA双链复制。
（2）条件
（3）过程
（4）结果：
上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。
PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
3．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较
（1）含义
①乳腺生物反应器是指使外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。
②工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。
（2）两者区别
比较项目
乳腺生物反应器
工程菌
基因结构
动物基因的结构与人类基因的结构基本相同
细菌和酵母菌等生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异
基因表达
合成的药物蛋白与天然蛋白质相同
细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性
动物的受精卵
微生物细胞
导入目的基因的方式
生产条件
不需严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取
从动物乳汁中提取
从微生物细胞中提取
1．将目的基因导入受体细胞整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，能否稳定遗传？
说明理由。
一般不能。
因为仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，细胞分裂可能导致目的基因丢失，因此无法稳定遗传。
2．用箭头及必要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。
（1）基因组文库的构建过程为：
某种生物全部DNA
许多DNA片段
受体菌群体。
（2）部分基因文库的构建过程为：
某种生物发育的某个时期的mRNA
cDNA
受体菌群。
1．基因工程操作的四个易错点
（1）目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
（2）基因工程操作过程中只有第三步（将目的基因导入受体细胞）没有碱基互补配对现象。
（3）农杆菌转化法原理：
农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的T DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
（4）启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；
起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
2．基因表达载体的构建方法
3．目的基因的检测与鉴定
◎考法1 考查基因工程的基本操作程序
1．（2018·
湖北武汉2月调研）如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。
请回答：
（1）A→B利用的技术称为________，其中②过程需要热稳定的________酶才能完成。
（2）图中将目的基因导入棉花细胞需要经过C过程，该过程为构建______________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达。
（3）上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是______________法，该方法一般________（填“适宜”或“不适宜”）用于将目的基因导入单子叶植物。
（4）从F→G的过程利用的主要技术为____________，欲确定抗虫基因在G体内是否表达，在个体水平上需要做________实验。
如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株占________。
（1）A→B是PCR技术中的操作，②过程是PCR技术中的延伸过程，需要耐热的DNA聚合酶参与。
（2）过程C是构建基因表达载体。
（3）图中显示，将目的基因导入棉花细胞的方法是农杆菌转化法，该方法不适于将目的基因导入单子叶植物，这是因为农杆菌对大多数单子叶植物没有感染力。
（4）F→G过程是将棉花体细胞培育形成新的个体，需要采用植物组织培养技术；
检测抗虫基因在转基因植株体内是否表达，在个体水平上需要做抗虫接种实验；
假设抗虫基因为A，则该杂合子基因型可以表示为A0，A0自交，后代中抗虫植株A_和非抗虫植株00分别占3/4、1/4。
（1）PCR TaqDNA聚合
（2）基因表达载体
（3）农杆菌转化 不适宜 （4）植物组织培养 抗虫接种 3/4
◎考法2 考查基因工程技术的应用
2．（2017·
全国卷Ⅱ）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。
通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。
（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________。
提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_________________________。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是
________________________________________________________________（答出两点即可）。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是
（1）与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。
提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。
（2）以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录（反转录）可以获得cDNA。
（3）因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。
（4）构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。
（5）转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。
（1）嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解
（2）在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA （3）目的基因无复制原点；
目的基因无表达所需启动子 （4）磷酸二酯键 （5）目的基因的转录或翻译异常
3．（2019·
福建高三质检）苜蓿是目前我国种植最广的豆科牧草，但是病菌往往威胁着苜蓿的生长。
为提高产量，研究人员将溶菌酶基因（LYZ基因）和绿色荧光蛋白基因（GFP基因）连接为LYZ GFP基因，利用农杆菌转化法将其导入苜蓿细胞中，并通过组织培养成功获得了抗病植株。
图1表示Ti质粒，其中Vir区的基因产物是T DNA转移的必备条件；
图2表示含有LYZ GFP基因的DNA片段。
图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
（1）构建含有LYZ GFP基因的重组质粒时，应选用限制酶________进行切割，原因是
（2）据图分析，在培育转基因苜蓿植株过程中，应选择LYZ GFP基因中的GFP基因为标记基因，而不选择质粒中原有的卡那霉素抗性基因为标记基因，这种做法的优点是________________________。
（3）在组织培养过程中，对愈伤组织进行显微检测，若________，则表明细胞中GFP基因存在并表达。
（4）选择含有GFP基因的愈伤组织为材料，用PCR技术扩增并检测LYZ基因，需选用一段____________________合成引物，该过程所用到的酶必须具有________的特性。
（5）对该苜蓿植株进行病菌接种实验，通过观察其抗病程度可以进行个体生物学水平的鉴定，原因是
（1）据图2可知，构建含有LYZ GFP基因的重组质粒时，含有LYZ GFP基因的片段有三个酶切位点，基因两侧没有相同限制酶，应该使用双酶切法，限制酶Ⅲ为必选。
根据图1结合农杆菌转化法的原理，所用限制酶切割位点必须在T DNA片段上，限制酶Ⅰ会切断Ti质粒本身的四环素抗性基因，但GFP基因、卡那霉素抗性基因都可以作为标记基因。
所以应选择限制酶Ⅰ和Ⅲ。
限制酶Ⅱ会破坏质粒中的Vir区的基因，不可选用。
（2）据图1可知，若LYZ GFP基因在T DNA片段上，就能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，便于追踪检测LYZ基因的表达情况，这是选用GFP基因为标记基因的优点。
而卡那霉素抗性基因不在T DNA片段上，不能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，
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