阿托伐他汀钙胶囊Word下载.docx
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压力蒸汽消毒器
LDZX-50-KBS
薄膜过滤器器
STV-3
1-28-00
4.2验证所需要的文件及存放地方
资料名称
存放地点
《SGSP-02电热隔水式培养箱操作维护保养SOP》
QC部
《MJ-01霉菌培养箱操作维护保养SOP》
《LDZX-50-KBS压力蒸汽消毒器操作维护保养SOP》
《水平层流净化工作台操作维护保养SOP》
《电动吸引器操作维护保养SOP》
《微生物限度检查法SOP》
5可接受的限度范围标准
5.1盐酸阿托伐他汀钙胶囊微生物限度检查质量标准
项目
标准规定
细菌总数
≤1000CFU/g
霉菌、酵母菌
≤100CFU/g
大肠埃希菌
不得检出
5.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%。
若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；
若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
5.3控制菌检查方法验证结果判断
若试验组检出试验菌（检出试验菌判断如下），按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；
若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。
5.3.1大肠埃希菌检查结果判断
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；
如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；
如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯培养基的平板上，培养18～24h。
若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判定供试品未检出大肠埃希菌。
若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。
培养基
菌落形态
曙红亚甲蓝琼脂
紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽
麦康凯琼脂
鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润
6测试方法
6.1供试品
阿托伐他汀钙胶囊：
批号141001、141002、141003
6.2培养基及菌种
6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，厂家均为:
北京三药科技开发有限公司。
6.2.2培养基
营养肉汤培养基（批号：
131115）改良马丁培养基（批号：
130809）
营养琼脂培养基（批号：
131016）玫瑰红钠琼脂培养基（批号：
131108）
胆盐乳糖培养基（批号：
131004）4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸培养（批号：
130709）
稀释剂：
PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：
1306202）
6.2.3菌种均购于：
湖南省食品药品研究所（第二代）
菌种名称
传代次数
枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501
第三代
金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003
大肠埃希菌CMCC（B）44102
白色念珠菌CMCC（F）98001
黑曲霉CMCC（F）98003
6.3菌液制备
6.3.1细菌、霉菌及酵母菌的检查菌液制备
6.3.1.1分别取30～35℃培养24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物各1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，制成每1ml含菌数50～100个cfu的菌悬液，备用。
6.3.1.2取23～28℃培养48h的白色念珠菌的改良马丁培养基培养物1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，制成每1ml含菌数50～100个cfu的菌悬液，备用。
6.3.1.3取23～28℃培养7天的黑曲霉菌改良马丁琼脂培养基培养物，加入3~5ml的含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后用无菌吸管（其管口用无菌纱布包扎）吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释，采用10倍递增稀释法，制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液，备用。
6.3.2控制菌的检查菌液的制备
取30～35℃培养24h的大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，制成每1ml含菌数50～100个cfu的菌悬液，备用。
6.3.3供试品制备
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：
10的供试液。
6.3.4菌落数确认
菌种
金黄色葡萄球菌10-7
大肠
埃希菌10-6
枯草芽
孢杆菌10-6
白色念
珠菌10-7
黑曲霉菌10-6
菌落数
52,57
60,66
51,58
65,68
50,55
6.3.5培养和计数：
细菌培养72小时，霉菌、酵母菌培养120小时，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至120~168小时进行菌落计数报告。
菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠培养基用于霉菌及酵母菌计数。
在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌，细菌菌落数。
然后将营养琼脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上细菌数与玫瑰红钠琼脂培养基上的霉菌和酵母菌或营养琼脂培养基上的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌落数为计数结果。
6.3.6菌数报告规则
细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300CFU、霉菌宜选平均菌落数小于100CFU的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。
以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g供试品中所含的菌数。
如各稀释级的平均均无菌落生长，或仅最低稀释级的平均板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以小于1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
6.3.7计算公式
试验组的菌回收率%＝
稀释剂对照组菌回收率（%）=×
100﹪
菌液组的平均菌落数
6.4验证步骤：
细菌、霉菌及酵母菌检验方法验证采用三批供试品，进行3次平行试验，分别人工污染上述5种代表试验菌株。
控制菌检验方法验证采用上述三批批供试品进行实验，人工污染大肠埃希菌。
6.5验证方法
6.5.1（细菌、霉菌计数）平皿法：
（按药典方法操作）
取制备好的浓度为1:
10的供试液1ml和1ml含菌数50~100cfu菌悬液，分别加入直径90cm的无菌平皿中，注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，细菌于30~35℃培养72h，霉菌于23~28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数。
6.5.1.1试验分组
6.5.1.1.1试验组
分别取不同批号1：
10供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，分别加入1ml含菌数50～100cfu/ml菌悬液，注入15~20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠营养琼脂培养基，混匀，凝固，分别于30~35℃培养72h，23-28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数（见附表1）。
6.5.1.1.2菌液组
分别取1ml含菌数50～100cfu/ml菌悬液，置直径90mm的无菌平皿中，注入15~20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠营养琼脂培养基，混匀，凝固，分别于30~35℃培养72h，23-28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数（见附表1）。
6.5.1.1.3供试品对照组
10供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15~20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠营养琼脂培养基，混匀，凝固，分别于30~35℃培养72h，23-28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数（见附表1）。
6.5.1.1.4稀释剂对照组
以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml作为稀释剂代替供试品，分别加入1ml含菌数50～100cfu/ml菌悬液，注入15~20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠营养琼脂培养基，混匀，凝固，分别于30~35℃培养72h，23-28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数（见附表1）。
6.5.1.2试验结果：
见附表1
6.5.1.3试验结论：
平皿法验证实验平均回收率结果（%）
试验组别菌种
枯草芽孢杆菌
金黄色葡萄球菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
稀释剂对照组
105.1
102.9
99.2
95.1
93.4
141001试验组
55.1
53.3
38.7
从上表中可以看出，稀释剂对照组回收率均>
70%，五个菌种回收率均<
70%,不可用平皿法对阿托伐他汀钙胶囊进行检测。
6.5.2（细菌、霉菌计数）培养基稀释法：
10的供试液1ml，等量分注置5个直径90mm的无菌平皿中，再分别将1ml含菌数50～100cfu/ml菌悬液置于以上5个平皿中，制备平行样，注入15~20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠营养琼脂培养基，混匀，凝固，细菌于30~35℃培养72h，霉菌于23~28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数。
6.5.2.1试验分组
6.5.2.1.1试验组
10供试液1ml，等量分注置5个直径90mm的无菌平皿中（0.2ml/皿），再分别将1ml含菌数50～100cfu/ml菌悬液置于以上5个平皿中，制备平行样，注入15~20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠营养琼脂培养基，混匀，凝固，分别于30~35℃培养72h，23-28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数（见附表2-10）。
6.5.2.1.2菌液组
分别取1ml含菌数50～100cfu/ml菌悬液，等量分注置5个直径90mm的无菌平皿中（0.2ml/皿），制备平行样，注入15~20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠营养琼脂培养基，混匀，凝固，分别于30~35℃培养72h，23-28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数（见附表2-10）。
6.5.2.1.3供试品对照组
10供试液1ml，等量分注置5个直径90mm的无菌平皿中（0.2ml/皿），制备平行样，注入15~20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠营养琼脂培养基，混匀，凝固，分别于30~35℃培养72h，23-28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数（见附表2-10）。
6.5.2.1.4稀释剂对照组
以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml作为稀释剂代替供试品，等量分注置5个直径90mm的无菌平皿中（0.2ml/皿），再分别将1ml含菌数50～100cfu/ml菌悬液置于以上5个平皿中，制备平行样，注入15~20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠营养琼脂培养基，混匀，凝固，分别于30~35℃培养72h，23-28℃培养120h，逐日点计，观察结果，计数（见附表2-10）。
6.5.2.2试验结果：
见附表2-10
6.5.2.3试验结论：
培养基稀释法验证实验平均回收率结果（%）
实验次数
人工染菌回收率（%）
1
85.2
95.3
97.7
96.2
101.9
90.7
91.4
98.1
2
87.3
96.8
89.6
98.5
92.0
100.9
92.2
94.4
104.6
3
91.5
102.5
96.1
103.1
98.4
101.0
91.7
4
89.3
97.1
99.3
91.3
90.1
99.0
90.8
101.8
5
89.0
92.5
92.1
97.4
95.7
6
91.0
106.7
93.1
90.6
102.4
96.5
101.4
95.0
7
87.6
98.2
103.9
91.9
101.5
106.4
108.2
99.1
8
87.1
100.7
94.1
102.2
93.7
109.9
106.2
93.2
9
89.5
93.6
90.3
104.0
结论：
从上表中可以看出，采用培养基稀释法（0.2ml/皿），阿托伐他汀钙胶囊供试品人工污染5株代表菌，该供试品的微生物限度试验回收率均高于70%，该产品可采用培养基稀释法（0.2ml/皿）进行细菌、霉菌及酵母菌的微生物限度检查。
6.5.3（控制菌大肠埃希菌计数）常规法：
取制备好的1:
10的供试液10ml，置灭菌胆盐乳糖培养基中，加入含菌数50～100cfu/ml菌悬液，置30~35℃培养24h。
取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养24小时，在366nm紫外灯下观察。
若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；
不呈现荧光，为MUG阴性。
观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；
呈试剂本色，为靛基质阴性。
本次对照应为MUG阳性和靛基质阳性。
6.5.3.1试验分组
6.2.3.1.1试验组
取制备好的1:
6.2.3.1.2供试品对照组
10的供试液10ml，置灭菌胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养24h。
本次对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
6.4.3.2阳性对照试验
取1ml50～100cfu/ml大肠埃希菌液，置灭菌胆盐乳糖培养基中，置30~35℃培养24h。
6.4.3.3阴性对照试验
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，置灭菌胆盐乳糖增菌培养基中，置30~35℃培养24h（分别作平行试验）。
6.4.3.4试验结果：
试验组与阳性对照MUG阳性，供试品与阴性对照为MUG阴性。
6.4.3.5试验结论：
阿托伐他汀钙胶囊供试品可采用常规法进行大肠埃希菌检查。
7异常情况处理
严格按照《微生物限度检查法SOP》操作，如在检测中出现不符合要求的情况出现，分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定的阿托伐他汀钙胶囊的微生物限度检查方法进行修改，并重新进行验证。
8测试结果
8.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果见附表1至10。
8.3按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果见附表11。
9结论
9.1按照《微生物限度检验操作规程》，我们设定了该产品的微生物限度检验方法，对阿托伐他汀钙胶囊批进行了微生物方法学验证，结果各项指标符合标准规定，证明该标准操作规程满足检验需要，符合GMP要求，可以使用。
9.2通过回收率的检验，采用培养基稀释（0.2ml/皿）阿托伐他汀钙胶囊供试品，人工污染5株代表菌，该供试品的微生物限度试验回收率均高于70%，可采用培养基稀释法（0.2ml/皿）进行细菌、霉菌及酵母菌的微生物限度检查。
可采用常规法进行大肠埃希菌检查。
10再验证周期
10.1阿托伐他汀钙胶囊因其它因素变更导致阿托伐他汀钙胶囊的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。
10.2国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。
检验员：
复核员：
部门负责人：
附表1
阿托伐他汀钙胶囊微生物限度检查法验证（平皿法）
试验时间：
2014.10.09批号：
141001
供试菌
营养琼脂培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
平均菌
落数（cfu）
回收率（%）
金黄色葡
萄球菌
试验组
0
/
菌液组
61
65
63
62
62.5
99.2
供试品对照组
埃希菌
35
40
37.5
55.1
67
69
68
70
73
71.5
105.1
孢杆菌
0.0
52
53
52.5
55
54
102.9
珠菌
30
32.5
53.3
60
59
57
58
95.1
20
21
20.5
38.7
50
49
49.5
93.4
检验员：
复核员：
部门负责人:
统计日期：
附表2
阿托伐他汀钙胶囊微生物限度检查法验证（培养基稀释法）
141001-1
85.2
60.5
95.3
64
97.7
48
50.5
96.2
51
56
53.5
101.9
58.5
90.7
64.5
61.5
46
91.4
51.5
98.1
供
升级会员 