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交出任务日期：
2011年3月9日；
完成日期：
2011年6月10日
学生交出全部设计（论文）期限：
指导教师：
学生签名：
高效液相色谱法分析硝基苯甲酸异构体
摘要
随着高效液相色谱这一新型分离分析技术的广泛应用，现在每天都有许多色谱工作者在研究使用高效液相色谱。
特定样品的最佳分离条件，只有通过实验才能得到。
本文便是运用安捷伦1100高效液相色谱仪分析硝基苯甲酸异构体，探索分离硝基苯甲酸异构体的最佳分离实验条件。
关键词：
高效液相色谱硝基苯甲酸分离条件
HPLCANALYSISNITROBENZOICACIDISOMERS
ABSTRACT
Withthehighperformanceliquidchromatographyseparationandanalysisofthisnewtechnologywidelyused,andnoweveryday,manyworkersinstudiesusinghighperformanceliquidchromatographychromatography.Theoptimalconditionsforaparticularsample,canbeobtainedonlybyexperiment.ThisarticleisbasedontheuseofAgilent1100HPLCanalysisofnitro-benzoicacidisomers,separationofnitrobenzoicacidisomerstoexplorethebestseparationconditions.
KEYWORDS:
highperformanceliquidchromatography;
nitrobenzoicacidisomers;
separationconditions
1前言
高效液相色谱自20世纪70年代问世以来，经过近30的发展，在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现在已成为化学学科中最有优势的分离分析方法之一。
高效液相色谱的应用范围十分广泛，几乎能够分析所有的有机、高分子、生物样品。
据估计，目前已知的化合物中，有80%的化合物需要用高效液相色谱法进行分离分析。
此外，对无机物的分析也有很好的效果，特别是对生命活性物质的分离分析，有着其它分析方法不可替代的作用，已广泛应用于石油化工，生物化学、临床医学、食品卫生、环境检测、医药工业、商品检验、地质勘探、油田开发等领域的分离分析。
对硝基苯甲酸（p-NBA）是一种重要的有机合成中间体,是合成许多药物、染料的基础原料。
但在合成过程中,相应产生邻硝基苯甲酸（o-NBA）与间硝基苯甲酸（m-NBA）。
因此,探讨它们混合物的分离分析对合成反应过程分析及相关化合物异构体之间的分析具有重要意义。
本文采用HPLC法研究这类异构体混合物的分离方法,可为在合成p-NBA过程中提供中控分析,也可为其他类似的同分异构体之间的分离分析探索一种方法。
Agilent1100系列组件外形设计独特、具有灵活多变的组合方式；
卓越的系统性能指标；
图形化的工作站友好界面，完善色谱分析领域。
在本文中详细介绍了Agilent1100高效液相色谱仪的操作规程和各种参数的设定。
本文便是运用Agilent1100高效液相色谱仪来分析硝基苯甲酸异构体，探索最佳分离条件。
2高效液相色谱仪
高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）也叫高压液相色谱（highpressureliquidchromatography）、高速液相色谱（highspeedliquidchromatography）、高分离度液相色谱（highresolutionliquidchromatography）等。
是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。
又因分析速度快而称为高速液相色谱。
高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。
HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；
进样系统要求进样便利切换严密；
由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。
HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。
使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。
高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
2.1组成及工作原理
高效液相色谱仪现在都是由一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需要单元组件组合起来，最基本的组件是高压输液系统、进样器、色谱柱、检测器和工作站（数据处理系统）。
此外可根据需要配置自动进样器、预柱、流动相和在线脱气装置和自动控制系统等装置。
图2-1是普通配制的带有预柱的HPLC的结构图。
高效液相色谱仪的工作流程：
高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入流动相，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到工作站，检测到到的信号在工作站记录、处理和保存，数据以图谱形式打印出来。
2.2液相色谱仪的应用
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。
HPLC能在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力，与试样预处理技术相配合,HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度,使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够分离复杂相体中的微量成分。
随着固定相的发展,有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。
由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用,流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域，成为解决生化分析问题最有前途的方法。
高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。
液相色谱-质谱连用技术受到普遍重视,如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等;
液相色谱-红外光谱连用也发展很快,如在环境污染分析测定水中的烃类,海水中的不挥发烃类,使环境污染分析得到新的发展。
3安捷伦1100高效液相色谱仪操作方法
3.1开机
（1）把用隔膜真空泵过滤的流动相放入溶剂瓶中，用专用注射器将溶剂瓶中的溶剂（已过滤的10%～30%异丙醇水溶液）引流冲泵，带有控制阀的管路（软管）最后控制在6-10滴/min。
（2）打开计算机,进入WindowsNT（或Windows2000）画面,并运行BootpServer程序（自动运行）。
（3）打开1100LC各模块电源，进行自检。
（4）BootpServer中出现7行命令行后，双击Instrument1Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。
（5）从“View”菜单中选择“MethodandRuncontrol”画面,单击”View”菜单中的“ShowTopToolbar”，“Showstatustoolbar”，“Systemdiagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。
（6）打开Purge阀（泵上黑色旋钮）。
（7）单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入泵编辑画面。
（8）设Flow：
5ml/min，设A通道100%，单击OK。
（9）单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pumpcontrol选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内无气泡从废液管排出为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。
（10）单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击PumpControl选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭Purge。
（11）单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：
1.0ml/min。
（12）单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。
也可输入停泵的体积，一般设为0.1L停泵，单击Ok。
3.2数据采集方法编辑
1、开始编辑完整方法：
从“Method”菜单中选择“Editentiremethod”项，如上图所示选中除“Dataanalysis”外的三项，单击Ok，进入下一画面。
2、方法信息：
在“MethodComments”中加入方法的信息（如：
方法的用途等）。
单击Ok进入下一画面。
3、泵参数设定：
（以二元泵为例）
在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“SolventB”处输入70.0,（A=100-B）,也可Insert一行”Timetable”,编辑梯度。
在“PressureLimitsMax”处输入柱子的最大耐高压（330bar），以保护柱子。
单击Ok进入下一画面。
4、VWD检测器参数设定
在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在”Peakwidth（Responsetime）”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间,如>
0.1min（2s）。
在Timetable中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min，波长=300nm。
点击ok进入下一画面。
5、柱温箱参数设定:
在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击“more>
>
”键,如图所示,选中”Sameasleft”---使柱温箱的温度左右一致。
点击ok进入下一画面。
6、在“Runtimechecklist”中选中“Dataacquisition”。
单击Ok进入下一画面。
7、单击“Method”菜单，选中“Savemethodas”，输入一方法名，如“test”，单击Ok进入下一画面。
8、从菜单“View”中选中”Onlinesignal”,选中Windows1,然后单击
Change钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击Ok进入下一画面.（如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows2）。
9、从“Runcontrol”菜单中选择“Sampleinfo”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Datafile”中选择“Manual”或“Prefix”。
区别:
Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖掉。
Prefix—在Prefix框中输入前缀，在Counter框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。
10、从Instrument菜单选择Systemon。
11、等仪器Ready，基线平稳，从Method菜单中选择“Runmethod”（F5），进样。
如果是手动进样也可直接从LOAD→INJECT，分析开始。
3.3手动进样
1、吸入样品先把进样针洗干净，然后用样品再润洗5次，以确保进样无杂质并确保针内没有吸进微小气泡。
2、进样动作在LOAD状态推针（图a），动作要平缓，以防样品冲出，进样后先切换到INJECT状态（图b），分析完后再切换到LOAD状态，再拔针，以防倒吸，产生气泡。
3、进样量进样量要么小于定量环（毛细管，有虹吸现象）体积的一半，要么满刻度进样（需要推进3～5倍定量环体积的样品）否则进样体积无重现性。
4、清洗在INJECT状态下清洗进样口。
5、废液口废液管的出口末端应与进针口水平，以防样品倒流泄漏或产生虹吸。
3.4数据分析方法编辑
1、从“View”菜单中，单击“Dataanalysis”进入数据分析画面。
2、从“File”菜单选择“Loadsignal”，选中您的数据文件名，单击Ok。
3
、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signaloptions”选项，。
从Ranges中选择Autoscale及合适的显示时间，单击ok,或选择”UseRanges”调整。
反复进行，直到图的比例合适为止。
4、积分:
（1）、从“Integration”中选择“Autointegrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“IntegrationEvents”选项，选择合适的Slopesensitivity，Peakwidth，Areareject，Heightreject。
（2）、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项，则数据被积分。
（3）、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。
（4）、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。
5、打印报告:
（1）、从“Report”菜单中选择“Specifyreport”选项，进入如上画面。
（2）、单击“QuantitativeResults”框中Calculate右侧的黑三角，选中Percent（面积百分比），其它选项不变。
（3）、单击Ok.
（4）、从“Report”菜单中选择“Printreport”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report底部的“Print”钮。
3.5关机
1关机前，用100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如ACN），待基线平稳，然后关泵，（适于反相色谱柱）。
[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]
2退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shutdown关）。
3关掉Agilent1100电源开关。
4药品及实验部分
4.1药品及仪器
实验仪器：
1、Agilent1100高效液相色谱仪：
可变波长检测器（G1314A）C8柱（φ4.6×
150mm，5um），
四元泵（G1311A）真空在线脱气机（G1319A）。
2、隔膜真空泵型号：
GM-0.33津腾2003年3月
3、真空干燥箱型号：
DZF-6050上海精宏实验设备有限公司
4、梅特勒-托利多B-S系列天平型号：
AB135-S梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
5、移液枪型号：
吉尔森P200北京吉尔森科技有限公司
6、容量瓶（50ml）烧杯玻璃棒胶头吸管
实验药品：
邻硝基苯甲酸：
分析纯天津市光复精细化工研究所2004年1月2日
间硝基苯甲酸：
化学纯天津市光复精细化工研究所2003年7月11日
对硝基苯甲酸：
分析纯
异丙醇：
色谱纯天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司2003年10月23日
甲醇：
色谱纯天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司2003年06月08日
水：
娃哈哈纯净水2011年02年07月
乙酸：
分析纯天津市博迪化工有限公司2007年11月01日
4.2实验方法
对硝基苯甲酸（p-NBA）是很重要的药物合成中间体，如将p-NBA还原，可以产生对氨基苯甲酸。
p-NBA的纯度对产品的产率影响很大，一般要求p-NBA的纯度要在99.5%以上。
然而，p-NBA中总是含有少量（约0.5%）的异构体杂质领硝基苯甲酸（o-NBA）和间硝基苯甲酸（m-NBA）。
因此，要准确定量p-NBA，首先要将这几种异构体分离。
本文采用反相HPLC分离这3种异构体，分离的原理是基于异构体之间极性的微小差异，在甲醇（或异丙醇）和水中的溶解度有微小的不同（分配系数不同），因而有可能实现三者的分离。
NBA是有机酸，在水中可部分离解成酸根阴离子，使之在流动相中的分配系数变得很大，在反相键和固定相C8中的保留变小，异构体相互之间可能完全不能分离。
因此，在流动相中需加入有机酸以抑制NBA的解离，这是实现分离的关键。
本文在流动相中加入乙酸就是这个目的。
1.溶液的配制
硝基苯甲酸（NBA）标准溶液（1000ug/ml）：
准确称取分析纯的o-、m-和p-NBA各50mg于不同的烧杯中，用乙醇溶解并分别定容于50ml容量瓶，其浓度均为1000ug/ml。
使用时可用乙醇或流动相稀释5～10倍，即浓度为100～200ug/ml；
样品
称量前/mg
称量后/mg
样品质量/mg
领硝基苯甲酸
13530.92
13480.63
50.29
间硝基苯甲酸
12769.45
12719.24
50.21
对硝基苯甲酸
13630.91
13580.59
50.32
配制后的浓度：
1005.8ug/ml
1004.2ug/ml
1006.4ug/ml
混合标准溶液：
分别用p200移液枪取p-NBA（100ug/ml），o-NBA（100ug/ml），m-NBA（100ug/ml）各0.1ml于1ml小瓶中，用乙醇或流动相稀释至刻度。
此混合溶液含p-NBA10ug/ml，含o-NBA和m-NBA各10ug/ml；
注：
所有样品都要用0.45um有机滤膜减压过滤
2分析
（1）按仪器操作说明开机，使仪器处于工作状态。
（2）设置色谱参数：
AgilentC8色谱柱（φ4.6×
150mm，5um）；
流动相（A）为异丙醇：
水=20：
80（体积比）；
流动相（B）为异丙醇：
乙酸=20：
80：
0.4（体积比），pH值约为2～3；
流速1.0ml/min；
色谱柱温度为室温；
可变波长检测器检测波长为254nm。
（3）先用流动相（A），待基线稳定后，通过六通阀注入硝基苯甲酸异构体各种样品标样，每次进3～5次，观察样品峰的重现性。
（4）在步骤（3）的基础上，改变进样量和进样浓度，分析出最佳进样量和进样浓度。
（5）根据步骤4结果配制相对应的混合标样，通过六通阀注入混合标样，当样品中所有色谱峰出完后，即可停止分析。
（6）改用流动相（B），待基线稳定后，再次手动注入标准单样。
分析比较各单样保留时间。
（7）用流动相B，待基线稳定后，通过六通阀注入混合标样，分析谱图。
（8）比较两种流动相的分离效果。
3注意事项：
（1）按实验室提供的仪器操作规程操作仪器。
（2）流动相中pH值可按实际分离情况进行调节。
4数据处理：
将流动相中含有乙酸和不含乙酸时各异构体的保留时间，峰高或峰面积整理成表，比较两种情况下的分离效果。
如下表：
硝基苯甲酸异构体单样加酸不加酸比较
次数
样品
保留时间/min
1
2
平均值
邻硝基苯甲酸
不加酸
1.141
1.116
1.135
1.131
加酸
2.747
2.738
2.735
2.740
3.007
2.995
2.971
2.991
8.249
8.243
8.242
8.245
3.2
3.217
3.203
3.207
9.573
9.487
9.408
9.484
硝基苯甲酸异构体混样加酸不加酸比较
试样次数
混样不加酸
2.006
1.905
1.912
1.941
3.560
3.117
3.091
3.256
4.013
3.474
3.431
3.306
混样加酸
2.716
2.708
2.713
8.115
8.099
8.054
8.089
9.326
9.304
9.253
9.294
5结果分析
由以上表格内容和谱图（见附录）分析结果可知，在用高效液相色谱法分析硝基苯甲酸异构体的过程中，实验条件的改变对定性结果有非常重要的影响。
在不加酸的样品分析中，样品峰的保留时间小，而且谱图峰有杂峰，混样分析中样品峰不能很好的分离，有拖尾的现象。
而在加酸以后，样品分析过程中可以看出，样品峰的保留时间长，混样分析中样品能够很好的分离。
这是因为硝基苯甲酸是有机酸，在水中可部分离解成酸根阴离子，使之在流动相中的分配系数变得很大，在反相键和固定相C8中的保留系数变小，这样会使硝基苯甲酸异构体相互之间可能完全不能分离。
因此，在流动相中加入有机酸乙酸，就是是为了抑制硝基苯甲酸的解离，这是实现硝基苯甲酸分离的关键。
致谢
本毕业论文是在我的指导老师牛老师的悉心指导下完成的。
在本实验完成之际，首先要感谢我的指导老师牛老师，在实验过程中，牛老师严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。
从课题的选择到实验的最终完成，牛老师都始终给予我们细心的指导和不懈的支持。
一直以来，在牛老师的指导下，我们不仅学会了相关的专业知识，更懂得在以后的工作中要有良好的职业素质，并不断的提升自己的道德修养。
其次我要感谢在实验过程中给予我们帮助的老师和同学。
正因为有了他们无私的帮助，我们的实验才可以顺利完成。
在这里我要向老师们致以我最真挚的谢意。
经过三个多月的长时间的努力，我的毕业设计终于完成了。
这是一次综合学习化学仪器分析的过程。
在此期间我了解和掌握了一些化学仪器的使用方法，例如高效液相色谱仪、隔膜真空泵、真空干燥箱等。
同时培养了动手能力和分析问题解决问题的能力，
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