平板分离技术与活菌计数实验报告Word文档下载推荐.docx
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本实验将采用平板划线分离法。
3.平板分离技术与活菌计数：
值得指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并非必然保证是纯培育。
因此，纯培育的肯定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。
有些微生物的纯培育要通过一系列的分离与纯化进程和多种特征
鉴定方能取得。
从混杂的微生物群体中取得只含有某一种或某一株微生物的进程称为微生物的分离与纯化。
平板分离法主要有：
（1）平板划线分离法，
（2）稀释涂布平板法。
后者除能有效分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数量。
平板菌落计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；
通过培育后在平板上形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，按照稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。
由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每一个菌落不必然是单个细胞生长繁衍而成，有的可能来自2个或多个细胞。
因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是此刻利用菌落形成单位（colony-formingunit，CFU）取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。
4.分离菌株的鉴定：
微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。
各类细菌在代谢类型上表现了很大的不同。
不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。
不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。
所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。
细菌的这种生化反映的多样性在自然界产生了两种结果：
第一、使自然界所有的有机分子都有可能取得分解；
第二、使不同细菌之间有了彼此作用和彼此依赖的基础。
另一方面，微生物生化反映是微生物分类鉴定中的重要依据之一，细菌的生化反映的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方式来利用，可以辨别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。
5.生理生化反映：
微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪等不能直接利用，必需依托产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。
胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些进程都可通过观察细菌菌落周围的物质转变来证明。
糖发酵实验是常常利用的辨别微生物的生化反映，在肠道细菌的鉴定上尤其重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，可是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差
异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。
IMViC是吲哚（indol）、甲基红（methylredtest）、伏-普（Voges-Prokauertest）和柠檬酸盐（citratetest）四个实验的缩写，主要用于快速辨别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。
吲哚实验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。
对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色）。
但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。
色氨酸水解反映：
吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反映：
6.实验整体思路：
在肯定取样环境以后，对微生物原样进行梯度稀释，产生适合的浓度进行涂板用于微生物的计数。
染色并镜检，利用形态学方式对微生物做一粗略的定位。
按照镜检设计相关生理生化实验作进一步定位。
按照以上取得的信息肯定微生物类群并加以定位。
三．实验器材：
1.实验菌种：
大肠杆菌金黄色葡萄球菌
2.培育基：
牛肉膏蛋白胨培育基，马铃薯培育基，固体油脂培育基，固体淀粉培育基，葡萄糖发酵培育基试管，乳糖培育基试管（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培育基，葡萄糖蛋白胨水培育基。
3.溶液和试剂：
50%乙醇，20%的甘油，硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、0.01％美兰水溶液，卢戈氏碘液，甲基红指示剂，5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，香柏油，二甲醇等。
4.土样：
山东大学中心校区图书馆前光草坪内地表10cm土样。
5.仪器和其他用品：
普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸馏水，盖玻片，吸水纸，无菌平板，无菌试管，U型玻棒，解剖刀，无菌吸管等。
四．操作步骤：
1.培育基的制备与分装。
（1）称量：
按培育基配方依次准确地称取药品。
（2）熔化：
在滚水浴锅中或电炉上加热熔化。
（3）调pH：
用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH至培育基所需pH。
（4）分装：
将溶化的固体培育基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培育基。
液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。
（5）加棉塞：
培育基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培育基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。
试管先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培育基名称、日期、组别。
2．无菌水的制备。
（1）用量筒量取90ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。
（2）用10ml吸管取9ml水于10支试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。
3．器皿的准备。
（1）培育皿的包装：
每10套一包，用牛皮纸包扎。
（2）吸管的包装：
首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。
（3）玻璃涂布棒的包装：
方式同吸管的包装。
（4）枪尖的包装：
放入枪尖盒，牛皮纸包装。
4．高压灭菌。
（1）将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，按照需要设定灭菌温度和时间（一般121℃，20min灭菌，若培育基中含有葡萄糖等成份时，113℃，30min灭菌）。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
（2）灭菌完毕，将试管培育基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。
培育基冷至50℃左右，倒平板。
5．微生物的分离与纯化。
（1）土壤稀释液的制备：
称取10g土壤，放入灭好菌的无菌水顶用玻璃珠打坏土壤，静置30min。
取10mL土壤原液于1号试管中，从中取1mL浸液于装有9mL无菌水的试管中，充分震荡后依次操作，将7支试管按稀释倍数别离记作0，-1，-2，-3，-4，-5，-6号试管。
（2）涂布平板：
别离取0度，-2度和-5度的试管中的土壤浸出液0.2ml于细菌培育基平板上，用刮刀涂布均匀。
再别离取
0度和-3度稀释液0.2mL于准备好的霉菌培育基平板上，涂布均匀。
相同稀释度的浸液涂布3个平板。
（3）培育：
将细菌培育基平板置于37℃恒温箱培育24h，将霉菌培育基平板置于27℃恒温箱培育3d。
（4）平板计数及菌落描述：
将培育好的细菌进行平板计数（理想为每平板上不多
篇二：
实验十微生物稀释平板计数、划线分离
实验十微生物稀释平板计数、划线分离
一、目的要求
1.学习平板菌落计数的大体原理和方式。
2.熟练掌握倒平板技术、系列稀释原理及操作方式，平板涂布及划线分离方式。
二、大体原理
平板菌落计数法是按照微生物在固体培育基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁衍而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。
计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取必然量的稀释菌液接种到培育皿中，使其均匀散布于平皿中的培育基内，经培育后，由单个细胞生长繁衍形成菌落，统计菌落数量，即可换算出样品中的含菌数。
这种计数法的长处是能测出样品中的活菌数。
此法常常利用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定和食物、水源的污染程度的检定等。
但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各类因素的影响。
三、器材
大肠杆菌悬液，牛肉膏蛋白胨培育基，1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4．5ml无菌水的试管，试管架和记号笔等。
四、操作步骤
（一）稀释平板计数
1．编号：
取无菌平皿9套，别离用记号笔标明10、10、10各3套。
另取6支盛有4．5ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10、10、10、10、10、10。
2．稀释
用1ml无菌吸管精准地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10的试管中，注意吸管尖端不要碰着液面，以避免吹出时，管内液体外溢。
然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。
另取一支吸管自10试管吸0．5ml放入10试管中，吸吹三次，……其余依次类推。
-1-2-1-1-2-3-4-5-6-4-5-6
3．取样
用3支1ml无菌吸管别离精准地吸取10、10、10的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培育皿中。
4．倒平板
于上述盛有不同稀释度菌液的培育皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培育基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培育。
5．计数
培育24小时后，掏出培育皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：
每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×
稀释倍数×
5
一般选择每一个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为适合。
同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很差异。
由10、10、10三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差差异，如相差较大，表示实验不精准。
平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。
平板菌落计数法的操作除上述的之外，还可用涂布平板的方式进行。
二者操作大体相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培育基溶化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃温室中烘烤30分钟左右，使其干燥，然后用无菌吸管吸取0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培育皿中的培育基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培育基内，然后再倒置于37℃的温室中培育。
（二）划线法分离
-4-5-6-4-5-6
图Ⅴ-3平板划线操作示用意
一、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培育基、高氏一号合成培育基和马铃薯蔗糖培育基别离倒平板，并标明培育基的名称。
二、划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取经稀释10倍的土壤悬液-环在平
板上划线（图Ⅴ-3）。
划线的方式很多，但无论哪一种方式划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。
常常利用的划线方式有下列二种：
图Ⅴ-4划线分离示用意
⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培育基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培育皿约70°
角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部份作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部份作第三次平行划线和通过第三次平行划线部份作第四次平行划线（图Ⅴ-4，A）。
划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培育。
⑵将挑取有样品的接种环在平板培育基上作持续划线（图Ⅴ-4，B）。
划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培育。
五、实验报告
1．结果
将计数结果填入下表。
2．思考题
（1）为何溶化后的培育基要冷却至45℃左右才能倒平板？
（2）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？
为何？
（3）同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是不是一样？
（4）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。
篇三：
微生物实验—三平板分离技术1
实验三微生物分离纯化技术
掌握浇注平板法、平板涂抹法和平板划线法分离微生物的大体原理和具体操作
二、实验材料
一、菌种
二、培育基：
牛肉膏蛋白胨培育基
3、试剂和仪器：
无菌水、无菌培育皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅
2人一组，每人别离用三种方式操作三个培育皿
三、实验原理
平板划线分离法是指把混杂在一路的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培育基表面通过度区划线稀释而取得较多独立散布的单个细胞，经培育后生长繁衍成单菌落，通常把这种单菌落看成待分离微生物的纯种。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁衍而来的，故必需反复分离多次才可取得纯种。
其原理是将微生物样品在固体培育基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
浇注平板法和涂布平板法是两种最常常利用的菌种分离纯化方式，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。
浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一适合稀释度的少量菌悬液加至无菌培育皿中，当即倒入融化的固体培育基，经充分混匀后，置室温下培育。
最后可从其表面和内层出现的许多单菌落当选取典型代表，将其转移至斜面培育后保留，此即为初步分离的纯种。
涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培育基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地徒步在装个平板表面，经培育后，在平板培育基表面会形成多个独立散布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培育后保留。
四、实验进程
（1）稀释平板法
A每组取培育皿2只，即每一个同窗做1只。
先在无菌培育皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。
B另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培育皿的一边；
C取已熔化的在水浴锅中保温45－50℃左右的培育基，别离倒入上述培育皿中（见图－2），轻轻转动培育皿，使菌液、培育基充分混匀摊平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37℃恒温培育。
（2）平板涂抹法
A每组取无菌培育皿2只（每一个同窗做1只）。
在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释
度、组别、班级。
B取已熔化的培育基倒入培育皿制成平板。
C凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀释液0.2mL放在平板上。
D用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。
倒置于37℃条件下培育。
（3）平板划线法
A每组取无菌培育皿2只，在皿底贴上标签，注明事项。
取已熔化的牛肉膏蛋白胨培育基，倒入平皿，制成平板。
B凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－3或10－4）在平板上划线。
持续划线法：
将挑取有样品的接种环在平板培育基表面作持续划线。
C划线完毕，盖上皿盖，倒置于37℃温室培育。
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