基础生物学实验技术动物生理学0410文档格式.docx
《基础生物学实验技术动物生理学0410文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基础生物学实验技术动物生理学0410文档格式.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
如蟾蜍仍有反射活动，表示脑和脊髓破坏不彻底，应重新破坏。
图2-1破坏蛙的脑和脊髓
2.剪除躯干上部、皮肤及内脏
用左手捏住蟾蜍的脊柱，右手持粗剪刀在前肢腋窝处连同皮肤、腹肌、脊柱一并剪断，然后左手握住蟾蜍的后肢，紧靠脊柱两侧将腹壁及内脏剪去（注意避开坐骨神经）,并剪去肛门周围的皮肤，留下脊柱和后肢。
3.剥皮
一只手捏住脊柱的断端（注意不要捏住脊柱两侧的神经），另一只手捏住其皮肤的边缘,向下剥去全部后肢的皮肤（图3-2）。
将标本放在干净的任氏液中。
将手及使用过的探针、剪刀全部冲洗干净。
图2-2剪除躯干及内脏
4.分离两腿
用鑷子取出标本,左手捏住脊柱断端,使标本背面朝上，右手用粗剪刀剪去突出的骶骨（也可不进行此步）。
然后将脊柱腹侧向上，左手的两个手指捏住脊柱断端的横突，另一手指将两后肢担起，形成一个平面。
此时用粗剪刀沿正中线将脊柱盆骨分为两半（注意，勿伤坐骨神经）。
将一半后肢标本置于盛有任氏液中备用,另一半放在蛙板上进行下列操作。
5.辩认蛙后肢的主要肌肉，蛙类的坐骨神经是由第7、8、9对脊神经从相对应的椎间孔穿出汇合而成，行走于脊柱的两侧，到尾端（肛门处）绕过坐骨联合，到达后肢背侧，行走于梨状肌下的股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟内，到达膝关节腘窝处有分支进入腓肠肌（图2-3）。
图2-3蛙后肢解剖图
图2-4分离坐骨神经（A）和坐骨神经腓肠肌标本
6.游离坐骨神经和腓肠肌
用蛙钉或左手的两个手指将标本绷直、固定。
先在腹腔面用玻璃分针沿脊柱游离坐骨神经,然后在标本的背侧于股二头肌与半膜肌的肌肉缝内将坐骨神经与周边的结缔组织分离直到腘窝，但不要伤及神经，其分支待以后用手术剪剪断。
同样用玻璃分针将腓肠肌与其下的结缔组织分离并在其跟腱处穿线、结扎。
7.剪去其它不用的组织
操作从脊柱向小腿方向进行。
（1）剪去多余的脊柱和肌肉
将后肢标本腹面向上，将坐骨神经连同2～3节脊椎用粗剪刀从脊柱上剪下来。
再将标本背面向上，用镊子轻轻提起脊椎，自上而下剪去支配腓肠肌以外的神经分支，直至腘窝（图3-4（A）），并搭放在腓肠肌上。
沿膝关节剪去股骨周围的肌肉，并将股骨刮净，用粗剪刀剪去股骨上端的1/3（保留2/3），制成坐骨神经-小腿的标本。
（2）完成坐骨神经腓肠肌标本
将脊椎和坐骨神经从腓肠肌上取下，提起腓肠肌的结扎线剪断跟腱。
用粗剪剪去膝关节以下部位，便制成了坐骨神经-腓肠肌标本（图3-4（B））。
8.检验标本
用沾有任氏液的锌铜弓触及一下（或电刺激刺激）坐骨神经或用鑷子夹持坐骨神经中枢端,如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，说明标本的兴奋性良好。
标本浸入盛有任氏液的培养皿中备用。
然后再依次用热玻棒、食盐（或1%H2SO4滤纸）刺激坐骨神经中枢端（或肌肉），观察肌肉收缩有何变化?
如果放上食盐肌肉无动静,用任氏液将盐冲洗掉,再观察冲洗过程中肌肉收缩有何变化?
[注意事项]
1.避免蟾蜍体表毒液和血液污染标本，压挤、损伤和用力牵拉标本，不可用金属器械触碰神经干。
2.在操作过程中，应给神经和肌肉滴加任氏液，防止表面干燥，以免影响标本的兴奋性。
3.标本制成后须放在任氏液中浸泡数分钟,使标本兴奋性稳定,再开始实验效果会较好。
4.热玻棒的温度防止过高,以免烫伤标本。
[思考题]
1.用各种刺激检验标本兴奋性时，为什么要从中枢端开始？
2.刺激有几种形式?
如何解释对食盐的不同处理对肌肉收缩的影响?
实验二水产动物血液常规检测
1.掌握鱼、虾、贝等水产动物的取血方法。
2.掌握鱼类红细胞和白细胞计数方法。
3.制作鱼类血涂片，观察并分类计数各类白细胞。
4.比色法测定鱼类血红蛋白含量。
二实验材料和用具
1.实验动物：
罗非鱼、南美白对虾、鲍。
2.实验用具：
刀具、纱布、吸水纸、试管、试管架、干净的载玻片和盖玻片、血球计数板、5ml管、移液枪和枪头、计数器、染色缸、显微镜,血红蛋白计、注射器、解剖盘。
3.试剂：
（1）红细胞稀释液（阿扬（Hayem）氏液NaCl1g，Na2SO4·
10H2O5g，HgCl20.5g，加蒸馏水至200mL过滤）。
（2）白细胞稀释液（冰醋酸0.1mL，1%龙胆紫1mL加蒸馏水至100mL，或直接用2%醋酸溶液）
（3）染液:
Gimsa-Wright染液
（4）固定液:
甲醇
（5）防凝剂:
1%肝素
（6）Gimsa-Wright染液配置：
原料:
A：
瑞氏染粉0.8--1克；
吉姆萨染粉0.5克
B：
甘油33ml
C：
甲醇500ml
将A放入研钵中，加入少量B研磨，再加入少量B研磨，倒出，将未溶部分，继续加入B研磨，全溶后，加入C，或中间加入C亦可。
混匀即可。
三实验方法与步骤
1、鱼类的取血方法：
（见附图）
取实验鱼，用纱布擦干鱼体，可根据鱼的大小选择断尾取血（较小的鱼），尾动脉或背主动脉以及心脏取血（可重复多次取血，一般鱼体长10cm以上）。
断尾取血：
从尾柄较细部位切断尾巴，吸水纸吸干尾动脉周围组织以去除粘液和水的污染，将预先经肝素处理过的收集管或毛细管放在尾动脉断开处收集血液。
连续取血：
用肝素浸润注射器并保留50－100μl的肝素溶液，尾动脉取血或背主动脉以及心脏取血。
2、虾和贝类取血方法
虾：
用注射器直接从头胸甲背面垂直刺入心脏取血；
鲍：
用解剖刀在腹足中线划出大约2mm深1cm长的切口，用滴管收集血液。
3、红细胞的计数（RBC）和白细胞的计数（WBC）
红细胞的计数（RBC）：
吸取3.98ml红细胞稀释液于试管中，用微量吸管吸取20μl血液，轻摇至均匀，用小管吸取该液，滴一滴到计数板上的盖玻片边缘,使血液均匀地散布于计数板的室内。
将计数板放在高倍镜（×
40）下进行计数，红细胞计数四周4个中方格和中央1个中方格;
然后把所得数据乘以对应的稀释倍数（10000）即得红细胞数/mm3。
白细胞的计数（WBC）：
取0.38毫升白细胞稀释液于试管中，用微量吸管吸取新鲜血液20微升,放入稀释液中,反复轻摇至均匀。
使用血球计数板在10倍显微镜下观察计数,数四个大方格的白细胞数.计算公式:
WBC=数得的白细胞数*50（/mm3）。
附：
血细胞计数板的使用方法
（一）熟悉计数室
血细胞计数板系一长方形厚玻片（图1），常用的改良牛氏（Improved-Neubauer）计数板在中央横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。
计数室比两边的盖玻片支柱低0.1毫米。
因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米。
在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成9个边长为１毫米的大方格。
四角的大方格又各分为16个中方格，这是用来计数白细胞的。
中央大方格被划分为25个中方格，每一中方格又划分成16个小方格（图2称25×
16，也有的计数板为16×
25的，小方格面积一致）。
中央大方格的四角及中心5个中方格（16×
25者则为四角上的中方格）为红细胞或血小板计数范围。
图1、血细胞计数板图2、改良牛氏血细胞计数板
“白”为计数白细胞的大方格
（二）血细胞计数方法
取干洁的计数板，置于水平的显微镜载物台上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。
摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜。
静置2min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃。
采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则（见图3）。
依次计数并记录5个中方格中分别有多少个红细胞。
图3、计数血细胞的线路
3血细胞观察与分类计数：
制作鱼类血涂片方法：
取新鲜血液一滴滴在载玻片的一端,用另一载玻片或盖波片使之与涂片成35°
-40°
角靠近血滴，并使血液充于两玻片之间，然后进行推片，形成一薄的血膜层。
让涂好的玻片自然风干,放入甲醇中固定2-3分钟。
将玻片从甲醇中取出,自然干燥,然后放入Gimsa-Wright染色缸中染色3-4分钟后，将染好色的玻片用自来水缓缓冲洗染液,自然干燥,显微镜下观察计数。
（取血涂片中间血细胞分散较开的区域进行计数。
）
白细胞分类计数方法：
计算200个白细胞中，各类白细胞所占百分数。
鱼类的血细胞类型：
（1）红细胞成熟的红细胞，细胞表面较光滑，大多数为卵圆形，核质比小，胞质丰富均一，胞质被染成浅红色，核较小，卵圆形，位于细胞中央，染为深蓝色。
（2）嗜中性粒细胞圆形或卵圆形，胞质丰富，染色很浅，胞质中有许多细小的颗粒，染成浅灰色，核染成红紫色，核多为圆形，位于细胞中央，染色质松散。
（3）嗜酸性粒细胞不规则圆形，核质比小，胞质丰富，含有大量嗜酸性颗粒，染成鲜艳的桔红色，核为蓝色偏向细胞一侧。
（4）嗜碱性粒细胞近圆形，胞质少，不易见，核质比大，核染成蓝紫色，核几乎充满整个细胞，核为不规则圆形。
（5）淋巴细胞呈不规则圆形，表面往往会伸出许多细小的指状突起。
核质比较大，细胞质呈一薄层。
（6）单核细胞圆形或不规则形状，体积大，胞质丰富，染成淡蓝色，内有许多空泡，细胞核占1/2——1/3大小，核染成蓝紫色。
（7）血栓细胞纺锤形、泪滴状，细胞较小，质膜表面大部分较平滑，个别部位有缺刻或突起。
核大，位于细胞中央，染成蓝紫色。
有些圆形血栓细胞成堆聚集。
白细胞分类计数（％）
嗜中性粒细胞
嗜碱性粒细胞
嗜酸性粒细胞
淋巴细胞
单核细胞
血栓细胞
4血红蛋白含量的测定--沙里氏血红蛋白计测定
［目的原理］了解和练习沙利氏比色法测定血红蛋白含量。
血液加入稀盐酸后，血红蛋白转化成不易变色的棕色的高铁血红蛋白，可与标准比色板进行比色，从而测得血红蛋白含量。
[实验对象与用品]人或动物。
沙利氏血红蛋白计、酒精棉球、０.１mol/L盐酸、蒸馏水等。
沙里氏比色法是用HCl使血红蛋白酸化形成棕色的高铁血红蛋白，然后和标准比色板进行比色。
（1）沙里血红蛋白计
（如图：
1－比色箱，2－吸血管，3－测定管）主要具有标准褐色玻璃比色箱和1只方形刻度测定管组成。
比色管两侧通常有两行刻度；
一侧为血红蛋白量的绝对值，以g·
dl-1（每100
ml血液中所含血红蛋白的克数）表示，从2～22
g；
另一侧为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，从10%～160%。
为避免所使用的平均值不一致，因此一般采用绝对值来表示。
（2）具体测定方法如下：
①用滴管加5～6滴，0.1mol·
L-1
HCl到刻度管内,（约加到管下方刻度”2”或多或10%处）。
②用微量采血管吸血至20
μl，仔细揩去吸管外的血液。
③将吸血管中的血液轻轻吹到比色管的底部，再吸上清液洗吸管3次。
操作时勿产生气泡,以免影响比色。
用细玻棒轻轻搅动，使血液与盐酸充分混合，静置10
min，使管内的盐酸和血红蛋白完全作用，形成棕色的高铁血红蛋白。
④把比色管插入标准比色箱两色柱中央的空格中。
⑤使无刻度的两面位于空格的前后方向，便于透光和比色。
用滴管向比色管内逐滴加入蒸馏水，并不断搅匀，边滴，边观察、边对着自然光进行比色，直到溶液的颜色与标准比色板的颜色一致为止。
⑥读出管内液体面所在的克数，即是每100
ml血中所含的血红蛋白的克数。
比色前，应将玻棒抽出来，其上面的液体应沥干净，读数应以溶液凹面最低处相一致的刻度为准。
换算成每升血液中含血红蛋白克数（g·
L-1）。
[注意事项]
1.取血前要做好充分的消毒。
2.血液要准确吸取20
μl，若有气泡或血液被吸入采血管的乳胶头中都应将吸管洗涤干净，重新吸血。
洗涤方法是：
先用清水将血迹洗去，然后再依次吸取蒸馏水、95%酒精、乙醚洗涤采血管1～2次，使采血管内干净、干燥。
作为学生练习，微量采血管可反复使用。
3.使用血红蛋白仪测定时，吸样管应插入试管底部，避免吸入气泡，否则会影响测试结果。
仪器连续使用时，每隔4小时要观察一次零点，即吸入文齐试剂，用“调零旋钮”使仪器恢复到零点。
仪器用完后，关机前要用清洗液清洗。
否则会影响零点的调整。
要求与思考题:
1.计算结果，报告中简要说明计算过程。
求出本组同学测定的均值并评价之。
2.了解各类稀释液成分，分析各物质的作用。
注意事项:
1.充液前应充分混匀血细胞悬液，充液要连续、适量，充液后应待血细胞下沉后再计数。
2.计数板、盖玻片、吸血管及测定管等用过后必须立即按要求洗涤干净。
组织建议:
将相同类型的计数板集中在一个组内，便于指导。
本实验属于基本操作，每位同学均应独立操作得出结果。
鱼类的采血方法
（1）断尾取血
从尾柄较细部位切断尾巴
吸水纸吸干尾动脉周围组织以去除粘液和水的污染
将预先经肝素处理过的收集管或毛细管放在尾动脉断开处收集血
若用毛细管血液会由于毛细作用自动流入管中。
（2）连续取血
连接注射器与针头
用肝素浸润注射器并保留50－100μl的肝素溶液
尾动脉取血
背主动脉取血
心脏取血
小心旋转注射器，拔掉针头，将血液注入收集管备用。
---引自http:
//www.aqualex.org/elearning/fish_haematology/english/
实验三不同食性鱼类消化酶活性的测定
一实验原理
胃蛋白酶是存在于动物胃液中的一种消化酶，能把蛋白质水解成为氨基酸，可特异地拆开由酪氨酸的氨基和二羧基氨基酸的羧基所形成的肽键，生成自由酪氨酸及含有酪氨酸的肽。
通过生化方法测定增加的酪氨酸量，即可了解胃蛋白酶活性的相对大小。
二实验目的
比较不同食性的鱼类胃蛋白酶活性的相对大小。
三实验方法与步骤
1．酶提取液的制备
（1）取肉食性活鱼一条置于冰盘中，沿腹中线剖开，将胃取出置于冰盘上。
用小剪刀沿胃小弯剪开胃，用少量冷的蒸馏水轻轻洗去胃内涵物，并用滤纸吸干胃表面水分，剪下约1g胃壁于表面皿上并称其重量：
然后把已知适量的胃组织置于50ml离心管中，加1ml0.2%HCl溶液，在低温下用电动匀浆机匀浆。
（2）将以上制备的匀浆用0.2％Hcl溶液稀释至10m1。
在室温下使之自溶约15min。
并不断用小玻璃捧搅拌，使胃蛋白酶充分提取出来，然后离心10min，其上层溶液即为肉食性鱼胃蛋白酶提取液。
把离心管保存于冰中，待用。
（3）取草食性活鱼一条，同上步骤制备1份草食性鱼胃蛋白酶提取液。
2.标准曲线的绘制
按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液（表1）。
表1
试剂
管号
1
2
3
4
5
6
蒸馏水
10
9
8
7
100ug/ml酪氨酸，ml
酪氨酸终浓度，ug/ml
20
30
40
50
测定步骤:
取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸0.5mL,各加入0.4mol碳酸钠2.5mL,再各加入已稀释的福林试剂0.5mL。
摇匀置于水浴锅中。
37℃保温发色20min在用721型分光光度计进行测定（波长660nm）。
将1～6号管所测得的光密度（OD）减去1号管（蒸馏水空白试验）所测得的光密度为净OD数。
为了清楚起见。
再列出表格如下（表2）。
表2
按表1制备的不同浓度酪氨酸，ml
0.5
0.4mol/LNa2CO3,ml
2.5
Forlin试剂，ml
OD值
净OD值
以净OD值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线（或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K）。
3．酶活性的测定
取试管4支,编号1、2,每管内加入样品酶液1mL（1加肉食性鱼酶液，2加草食性鱼酶液）,置于37℃水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心（2000rpm，5min）或过滤,然后另取15×
150mm试管2支,编号1、2,每管内加入滤液0.5mL,再加0.4mol碳酸钠2.5mL,已稀释的福林试剂0.5mL,摇匀,37℃保温发色20min后进行光密度（OD）测定。
空白试验也取试管2支,编号
（1）、
（2）,测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。
为了清楚起见,分别列出表格于下（见表3及表4）。
表3
（1）
（2）
预热酶液，ml
预热0.2%酪蛋白，ml
0.4mol三氯乙酸，ml
作用10min（精确计时）
-
表4
试剂
管号
滤液，ml
0.4molNa2CO3，ml
Forlin,ml
计算
在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
样品蛋白酶活力单位=（A/10）×
8（活力单位/ml）
式中:
A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值×
K）;
4——4毫升反应液取出0.5mL测定（即8倍）
10——反应10min
[注意事项]
1．制备酶提取液时，一定要在冷冻条件下操作，否则蛋白酶会变性。
2．因Fo1in试剂在碱性溶液中易分解，因此，每次添加此试剂时应尽可能迅速，并保持速度一致。
实验四温度对水产动物能量代谢的影响
本实验采用流动式装置（图—1），应用Winkler碘量测氧法，测定单位时间内流过实验动物管水体中溶解氧的减少，间接求出动物的耗氧率。
Winkler法测定溶解氧的原理是：
在—定量的水样中加适量MnS04和KI-NaOH试剂。
生成的Mn（OH）2被水中的溶解氧氧化为褐色沉淀[主要是MnO（OH）2]、溶液酸化后、沉淀溶解，同时析出与溶解氧等当量的游离碘，用Na2S2O3溶液滴定，用淀粉试剂指示终点。
各步骤反应式如下：
二实验方法与步骤
1．水样瓶容积的校准将水样瓶洗净晾干后．用500ml量筒直接定容即可。
注意水的体积应是盖上盖子后的体积。
2．实验
（1）按图5-1所示装置，打开实验动物玻璃管—端的橡皮塞，将大小合适的活鱼一条小心地放进玻璃管中，让鱼头部位于入水管一端。
套上橡皮塞，用止水夹调节水流速度在每分钟100-200ml之间，避免机械及强光刺激，使鱼体保持安静状态约半小时以上。
（2）应用控温仪、电热器、搅拌器控制水槽的温度，保持恒定。
（3）测定水流速度采水样前，用100m1量筒在采水管出水口测量水流速度。
采水样后再复测一次，取平均值，得流速ml/h。
（4）水样采取与固定用水样瓶（预先编号）在采水管出水口取两瓶水样。
并固定。
方法是将—端带有玻璃管的橡皮管（长20-30mm套在采水管上，将玻璃管插到水样瓶底部。
先注入少量水，将瓶子冲洗两次．然后让水慢慢注入（注意，玻璃管要不离开水面），当水样装满并溢出约水样瓶容积的1／3，则抽出橡皮管，迅速用移液管加入1m1MnS04溶液，再加入1m1KI-NaOH溶液（加液时，移液管下端应伸入液面下约lcm处，随着试剂的流出，逐渐将移液管提起．盖上瓶盖、瓶中不应有气泡存在，然后用手指压紧瓶盖。
上下颠倒摇动水样到溶液混合均匀为止，此即为终点水样，记录瓶号及水温，放置于暗处。
（5）用虹吸法从呼吸前贮水瓶中采取一瓶水样作为对照，即起始水样．方法同上，记录。
（6）通过控温仪的调节提高恒温水槽水温；
从室内水温开始，直至接近该种动物生活水温的上限（随不同种类而异）。
（7）实验完毕，将鱼取出，用滤纸吸干鱼体表面水分，称重，得湿体重W（g）。
3．水样溶解氧含量的分析
（1）0.005mol／LNa2S203溶液的标定准确吸取20m10.005mo1／LK2Cr203溶液于250ml三角瓶中后，加入10m110％KI溶液及10m12mo1／LH2S04溶液，盖上表面皿，在暗处放置5min后，加入l00m1蒸馏水。
然后顺着瓶壁放入一个转子，开动电磁搅拌器，用0.005mo1／LNa2S203溶液滴定，当溶液由棕色变为淡黄色时，加入lml0.5％淀粉溶液，继续滴定（速度不能太慢），至溶液的蓝色消失，记下滴定液的毫升数。
重复标定，两次读数不应超过0.05m1。
反应式如下：
（2）水样固定1小时或沉淀降至瓶高的一半时，打开瓶盖，加入1m11:
1H2S04溶液，塞紧瓶塞，颠倒摇动水样瓶至沉淀全部溶解。
将水样瓶中的溶液
升级会员 