实用pcr流程表完整Word文档格式.docx
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检验项目：
HBV-DNA本次实验用量：
人份；
剩余量：
人份
其他有关试剂配制：
仪器设备使用：
离心机：
□正常□不正常；
振荡器：
□正常□不正常；
生物安全柜：
口正常口不正常
实验后：
□按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。
□按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。
HBV-DNA
样本处理区
HBV-DNA阳性室内质控物来源：
浓度及批号：
扩增位置：
HBV-DNA阴性室内质控物来源：
批号：
所处理的HBV-DNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：
1
9
17
25
33
41
49
57
65
73
81
89
2
10
18
26
34
42
50
58
66
74
82
90
3
11
19
27
35
43
51
59
67
75
83
91
4
12
20
28
36
44
52
60
68
76
84
92
5
13
21
29
37
45
53
61
69
77
85
93
6
14
22
30
38
46
54
62
70
78
86
94
7
15
23
31
39
47
55
63
71
79
87
95
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88
96
核酸提取及加样过程：
□按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。
生物安全柜：
□正常□不正常；
恒温金属浴：
℃；
低温离心机：
制冷：
离心：
□正常□不正常
口使用后标本冷冻保存3个月，以备复查。
HBV-DNA
扩增及产物分析区
实验室温度℃（允许范围：
LightCycler扩增仪操作：
□开机自检及运行正常；
□按LightCycler操作使用SOP进行编程、参数设定
HBV-DNA标准曲线计算值：
Slope值：
Intercept值：
r2值：
室内质控结果：
阴性质控物结果：
；
阳性质控物结果：
口填写室内质控记录、质控图；
是否失控：
口否 口是
失控原因及分析：
（失控判断标准及原因分析按室内质控SOP进行）
实验结果：
见所附扩增仪打印结果
实验结果有效性判断：
□有效□无效（依据实验结果有效性判断SOP进行）
1.操作步骤：
1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。
（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）
1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。
1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.
1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。
（注意：
不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。
1.2.556摄氏度温浴15分钟。
瞬时离心，以去除管盖上的滴液。
1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。
在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。
注意：
如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。
1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤中的液体移入核酸提取柱中。
盖上盖子，6000*g离心1分钟。
倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）
1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。
1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。
1.2.1120000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。
1.2.12丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的1.5ml离心管中，打开提取柱的盖子，
56摄氏度温浴3分钟，以彻底去除残余的液体。
1.213将核酸提取柱放入另一干净的1.5ml离心管中，小心打开提取柱的盖子，加入60ul洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央），盖上盖子，室温静置5分钟。
20000*g高速离心1分钟收集滤出液，做好标记，4摄氏度保存备用。
提取的病毒核酸应在2小时内用于PCR扩增，或在-70摄氏度下可以保存一个月。
2.扩增试剂准备（PCR前准备区）
从试剂盒中取出HCVRT-PCR反应液、EnzymeMix,在室温下融化后，2000*g离心5秒。
设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管）为n（n=样本数+1管空白对照+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准品），每个测试反应体系配制如下表：
试剂
HCVRT-PCR反应液
EnzymeMix
用量
n*13ul
n*2ul
计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。
3.加样（样本处理区）
吸取10ul样本处理步骤中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到上述反应管中（空白对照直接加入10ul洗脱液），盖紧反应管管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。
将毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
4.RT-PCR反应（检测区）
4.1循环条件设置
Program
Cycles
Temperature摄氏度
IncubationTime（min:
sec）
Temperature
Transition
Rate（摄氏度/sec）
Acquisition
Mode
Analysis
1
50
30:
00
20
None
None
95
15:
45
00:
05
20
Quantification
Single
72
10
反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书。
4.2仪器检测通道选择
选择F1检测通道：
HCV内对照（IC）选择F2检测通道。
4.3样本的设定
在扩增开始前条件设定时，将HCV定量标准品设为“Standard”并输入试剂盒内给定浓度值，待检样本和对照品设定为“Unknown”。
结果分析条件设定
1.对HCV的曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。
2.分析方式选择FitPoints，基线调整选择Arithmetic,阈值（threshold）设定原则以阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点，且正常HCV阴性对照病毒滴度为0.0IU/ml为准。
具体设置方法请参照各仪器使用说明书。
质控标准
1.将HCV定量标准品1-4的浓度值输入，仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横坐标，以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度绝对值应大于等于0.980，四个HCV定量标准品的Ct值都应<
38.0，否则视为定量结果无效。
2.HCV阴性对照、空白对照HCVRNA应为0.0IU/ml；
HCV强阳性对照HCVRNA应为5.0E+05-1.0E+07IU/ml；
HCV临界阳性对照应为1.0E+03-1.0E+05IU/ml；
且HCV阴性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，否则此次实验视为无效。
所有实验从样本处理开始重做。
结果判断
1.检测样本中1.0E+03IU/ml小于等于HCVRNA小于等于5.0E+07IU/ml，测定结果有效，可直接报告相应的浓度值。
2.检测样本中HCVRNA大于5.0E+07IU/ml，可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦可将该样本用正常人血浆按10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。
3.检测样本中0.0IU/ml小于HCVRNA小于1.0E+03IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，表明病毒载量较低，可直接报告浓度值，但注明该病毒滴度量仅供参考。
4.检测样本中HCVRNA等于0.0IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，应报告为小于试剂盒最低检测限。
5.检测样本中HCV内对照（IC）的Ct值大于33或Ct值为无数值，且HCVRNA小于等于1.0E+03IU/ml（包含0.0IU/ml或无数值）时，则此样本的定量结果视为无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
员工考勤签到表
2021年1月
姓名
日期
上午
下午
注：
本签到表由本人上班前5分钟内进行签字，不得代签、补签、迟签.。
对迟到20分钟以下者，记为迟到（Φ）；
对迟到20分钟以上者，记为缺勤（O）；
对上班时间擅自离开工作岗位者，记为早退（T），由考勤员记录。
考勤员每天负责对签到表进行审核，对未签到人员根据实际情况在签到表上做相应标记，即事假（x）、
病假（+）、公休（△）、倒休（d）、缺勤（O）。
本考勤签到表作为月末考勤记录的参考依据。
2021年7月
7-23周五
7-24周六
7-25周日
7-26周一
7-27周二
7-28周三
7-29周四
7-30周五
7-31周六
8-1周日
8-2周一
8-3周二
7-27周三
7-28周四
7-29周五
7-30周六
7-31周日
7-18周一
7-19周二
7-20周三
考勤员：
2021年3月
7-21周四
7-22周五
7-23周六
7-24周日
7-25周一
7-26周二
年月
本签到表由本人上班前5分钟内进行签字，不得代签、补签、迟签，考勤员负责监督。
考勤员每天负责对签到表进行审核，对未签到人员根据实际情况在签到表上做相应标记，即事假（x）、病假（+）、公休（△）、倒休（d）、缺勤（O）。
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