多种干货多糖含量测定及抗氧化性的研究文档格式.docx

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1.3.3多糖含量的测定方法................................................................................5

1.3.4多糖对羟基自由基（·

OH）消除作用的测定方法....................................51.3.5多糖对超氧自由基（·

O2-）消除作用的测定方法.....................................6

2结果与分析.....................……………………………………….............................6

2.1干木耳粗多糖提取的条件优化及含量的测定.........……………………..6

2.1.1浸提时间对多糖提取的影响....................................................................6

2.1.2浸提温度对多糖提取的影响....................................................................6

2.1.3浸提料液比对多糖提取的影响................................................................7

2.1.4提取工艺的优化........................................................................................7

2.1.5标准曲线的测定和回归方程的建立........................................................8

2.1.6干木耳的粗多糖的含量测定....................................................................8

2.2干枸杞的粗多糖的含量测定..............…..….……………………………..9

2.3干海带的粗多糖的含量测定..........................……...……………………..9

2.4干百合的粗多糖的含量测定......……………..………..………………....9

2.5干银耳的粗多糖的含量测定.......................................................................9

2.6干红枣的粗多糖的含量测定.......................................................................9

2.7干茶树菇的粗多糖的含量测定.................................................................10

2.8多糖对羟基自由基（·

OH）的清除作用....…………………………….....10

2.8.1茶树菇多糖..............................................................................................10

2.8.2干百合菇多糖..........................................................................................112.8.3枸杞多糖..................................................................................................11

2.9多糖对超氧自由基（·

O2-）消除作用.....……………………………....…12

2.9.1茶树菇多糖..................................................……………..……..…..…..12

2.9.2干百合多糖..........................................................………………..……..12

2.9.3枸杞多糖..................................................................................................13

3结论...............................………...…..……………………………………………13

3.1干木耳多糖提取的优化..........…………….…………………………..…13

3.2多糖的含量.............................................……..……………..…................13

3.3抗氧化活性........…………..………….......................................................13

4未来展望………….………..…….………………………………...…………….14

参考文献……………………………………………………………………..………15

致谢………………………………………………………………………………..…16

摘要：

本文选用热水浸提法对干木耳的多糖进行了粗提取，同时研究了不同提取料液比、时间、温度对干木耳多糖提取率的影响。

运用了单因素变量法和正交实验组合得出了提取干木耳多糖的最优的条件：

浸提温度90°

C，浸提时间3.5h，浸提料液比1:

40，提取率为17.02%。

并且用同样的方法提取多种不同干货的多糖，硫酸-蒽酮法测定了各自多糖含量。

选取的枸杞、茶树菇、百合三种干货在不同的抗氧化体系中均有抗氧化性，多糖的浓度与抗氧化能力成一定的剂量-效性关系。

以维生素C为参照、同浓度条件下：

茶树菇的抗氧化能力比维生素C强，百合的抗氧化能力和维生素C差不多，枸杞的抗氧化能力比维生素C低。

关键词：

热水浸提；

提取；

含量测定；

抗氧化性

Researchavarietyofdrypolysaccharidecontentandantioxidantactivity

CollegeofChemistryandChemicalEngineering

10ChemicalEducation

ChenChen21007011006

Doctor:

ZhangNa（Lecturer）

Abstract:

Inthispaper,thehotwaterextractionmethodwasusedtocrudelyextractpolysaccharideofdryblackfungus,andtheeffectsofdifferentratiosofsolidtoliquid,timeandtemperatureontheextractionratewerealsostudied.Byapplyingsinglefactoranalysisandorthogonaloptimizationexperiment,theresultsoftheoptimumextractionconditionswereobtainedasfollows:

extractiontemperature（90°

C）,extractiontime（3.5h）,ratioofsolid 

to 

liquid（1:

40）,andextractionrate（17.02%）.Inthesameway,weextractedpolysaccharideofvariouskindsofdrygoodsandalsoidentifiedeachpolysaccharidecontentwiththeanthrone-sulfuricacidmethod.Theselecteddrygoodsasmedlar,agrocybecylindraceaandlilyallhaveinoxidizabilityindifferentantioxidantsystems.Therearesomedose-effectrelationshipsbetweentheconcentrationofpolysaccharideanditsantioxidantcapacity.Underthesameconcentrationconditions,comparedwithVitaminC,itcanbeobtainedthattheantioxidantcapacityofagrocybecylindraceaisbetterthanthatofVitaminC,theantioxidantcapacityoflilyisalmostthesameasVitaminC,andtheantioxidantcapacityofmedlarisworsethanthatofVitaminC.

Keywords:

Hotwaterextraction;

extraction;

determination;

antioxidantactivity

引言

干货是指去除了水分的食品。

通常用晾晒、风干等方法来处理。

中国是一个饮食大国，干货市场随处可见，它已经成为了我们生活中必不可少的食物之一。

干货中含有蛋白质、植酸、多糖等营养成分，经过大量研究证明、这些都具有很高的营养价值。

本文主要是针对干货中的多糖进行提取并且研究它的抗氧化活性。

多糖是由大于10个单糖失水、缩合而组成的高分子碳水化合物。

实质是一种糖链，由糖苷键结合而成。

从20世纪下半叶以来，人们发现多糖具有很多的功能特点和生物活性。

在临床方面有抗病毒、抗癌、免疫调节、降血糖、治疗等作用；

在生活中也有美容的功能；

在工业中可用于乳化[1-3]。

近年来对多糖的提取优化工艺研究比较多，关于多糖的含量测定和它的抗氧化性质研究还是相对较少的。

经过科学研究显示，大多数疾病、衰老、癌症的发生都与过量的自由基有关系。

多糖的抗氧化活性可以通过消除自由基，使这些危害被有效的克服。

所以抗氧化是化妆品、医学治疗等方面的重点研发方向之一。

本文中选用了七种干货，选其中一种干货木耳，采用热水浸提法，进行浸提条件的优化工艺的研究[4]。

再用硫酸-蒽酮法测得它的多糖含量（因为糖类在比较高的温度下能被浓硫酸作用而脱水为糖醛，糖醛然后与蒽酮脱水缩合生成的这种物质是呈蓝绿色的糖醛衍生物，且在625nm处有最大吸收，可溶性糖溶液与它颜色深浅成正比）[5]。

使用同一种方法对其他干货多糖进行了提取及含量测定。

再从中选取三种干货多糖在不同的抗氧化性体系中进行研究，以维生素C为参照，比较他们的抗氧化能力。

此次实验中选取的七种干货：

木耳，真菌类的一种。

种子实体杯状、耳朵状、叶状，边缘似波浪形，较薄，色泽黑，可以用于防治缺铁性贫血、延缓衰老。

枸杞，味道有点甜，可以明亮眼睛，滋养肝和肾。

百合，属于多年生草本球根植物，基部稍宽，顶部尖，略向内弯，无嗅味苦。

可以用来降火、润肺、安神等。

海带，一种大型海藻类的植物之一。

晒干后为黑色，含有丰富的矿物质、中等的蛋白质和多糖。

银耳，真菌界的银耳目银耳属，洁白半透明，晒干后质地硬。

有补肾美容等作用。

红枣，植物界枣属，含有丰富的维生素，味甘，有补血抗衰老等功效。

茶树菇，是一种口感极好，富有很高营养价值的食用菌类。

晒干后，颜色黄褐，有浅皱纹。

选取的这七种干货，产量高，价格适中，取材方便，营养价值高，功效多，都有很好的开发前景。

1材料与方法

1.1实验材料与试剂

木耳、枸杞、干海带、干百合、干银耳、干红枣、干茶树菇，均购买于黄山市大润发超市。

取一定量的干货样品于真空烘箱中低温烘干，用粉碎机粉碎，用40目筛筛取，留着备用。

无水乙醇，邻苯三酚，双氧水，邻菲罗啉，磷酸盐-生理盐水缓冲溶液（用分析天平称7.9000g氯化钠，0.2000g氯化钾，0.2400g磷酸二氢钾和1.8000g磷酸氢二钾，溶于800mL蒸馏水中，用盐酸调节溶液pH为7.4，然后加蒸馏水定容到1L），硫酸亚铁，葡萄糖为国产分析纯，蒸馏水，维生素C溶液，蒽酮-硫酸溶液（称量0.2g的蒽酮，加入100mL、质量分数98%的浓硫酸溶液，摇匀，放在棕色试剂瓶中，低温保存），无水丙酮，Tris-HCl（pH=8.20，0.05mol/L）缓冲溶液（称取25gTris试剂溶于蒸馏水中，加8mL浓盐酸溶液，然后定容至1L，高压、高温灭菌后室温下保存）。

1.2实验器材

RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、AL104电子分析天平（瑞士梅特勒托利多仪器有限公司）、UV-1100紫外-可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）、离心机、SHA-水浴恒温振荡器（江苏省金坛市医疗器械有限公司）、PHS-3C型pH计（上海天达仪器有限公司）、真空抽滤机、DF-101干燥箱、锥形瓶、吸量管（1mL、2mL、5mL）、洗耳球、比色管、容量瓶。

1.3实验方法

1.3.1粗多糖提取的方法

多糖的提取一般有超微波辅助法、微波辅助法、酶法、热水浸提法。

本文所用的是热水浸提法。

它的原理是在热力作用下，细胞的质壁分离。

水溶剂渗入到细胞质、细胞壁中，溶解了液泡里的物质，并且通过细胞壁扩散到外部。

取一定量预处理过的样品，按1:

10的料液比加入95%（V/V）的乙醇，低温浸泡12h。

过滤，滤渣按一定的料液比加入蒸馏水，热水浴中保温一定时间。

减压抽滤得到滤液，滤渣二次浸提，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至原来体积的1/4，加入3倍于浓缩液的95%（V/V）乙醇，3℃下放置过夜，密封好，当有粒状沉淀和絮状胶状物产生后，用离心机以30分钟、3000r/min去上清液，沉淀复溶再离心、抽滤后，用无水丙酮、乙醇多次洗涤，干燥得到样品的粗多糖提取物，备用。

多糖提取率=多糖质量/样品质量×

100%

1.3.2标准曲线的绘制[6]

先打开紫外分光光度计进行预热。

清洗七个比色管，干燥编号备用。

然后用分析天平称取0.1020g分析纯葡萄糖，蒸馏水溶解后，完全转移到100mL容量瓶进行定容，得0.1020mg/mL的葡萄糖标准溶液。

然后用1mL的吸量管分别移取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL的葡萄糖标准溶液于干燥的比色管中，再用2mL的吸量管分别移取0.90、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00mL的蒸馏水到比色管中，补至1.00mL。

将七个比色管放在冰水浴中，用5mL的吸量管迅速移取4.00mL的蒽酮-硫酸溶液分别加入比色管内，摇匀。

然后将7个比色管放在沸水浴中加热10分钟后，取出来，放在盛有自来水的大烧杯中冷却至室温。

用紫外分光光度计从低浓度到高浓度在625nm波长下，分别测定它们的吸光度。

记下数据，以吸光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，用excel绘制葡萄糖溶液的标准曲线，得到相关系数和回归方程。

1.3.3多糖含量的测定方法

用电子天平称取样品粗多糖提取物0.1000g，三份，蒸馏水溶解后，完全转移到100mL容量瓶中并且摇匀定容。

移取0.40mL的稀释液于25mL的比色管中，再移取0.60mL蒸馏水补齐到1.00mL,将比色管放入冰水浴中，迅速加4.00mL的蒽酮-硫酸溶液，摇匀。

然后放在沸水浴中加热10分钟，取出，放在乘有自来水的大烧杯中冷却至室温。

以蒸馏水为参比，迅速用紫外分光光度计在625nm的波长下，测得它的吸光度，然后代入回归方程求出多糖的浓度，并且算出多糖在样品粗提取物中的含量。

OH）消除作用的测定方法[7]

本文采用的是用Fenton法反应形成羟基自由基的体系。

Fe2+与H2O2在Fenton反应中产生羟基自由基的方程式如下：

===

向该反应体系中加入邻菲罗啉，由于羟基自由基活性很高，能够很有效的被邻菲罗啉所结合，产生有色物质。

有色物质在510nm处有最大吸收。

当加入多糖溶液后，多糖溶液就会与羟基自由基结合，减少了邻菲罗啉与羟基自由基结合而生成的有色物质，减弱了在510nm处的吸光值。

通过测定添加了多糖溶液的体系的吸光度来判断它的消除能力。

方法如下：

首先用分析天平精确称量提取的样品粗多糖沉淀1.0000g，用蒸馏水溶解后，在100mL的容量瓶中定容，配成浓度为1.000mg/mL的母液，取母液进行稀释至浓度为0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL。

配制维生素C溶液用同样的方法。

取6支干燥且干净的比色管，依次编号、分别向里面加入1.5mL的邻菲罗啉溶液，磷酸盐-生理盐水（pH=7.4）缓冲溶液3.80mL，和0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL的多糖溶液0.50mL混匀（注：

1号为空白对照，用蒸馏水代替多糖溶液）。

再加0.75mmol/mL硫酸亚铁溶液1.50mL，迅速摇匀，再加0.01%的过氧化氢溶液1.00mL，将五支比色管放在38℃的热水浴中反应1小时，然后迅速测定各管在510nm下的吸光度。

再将维生素C药片研磨，称取，配制同浓度的维生素C溶液作对比。

清除率的计算：

·

OH清除率=（A0-A样品）/A0×

100%

1.3.5多糖对超氧自由基（·

O2-）消除作用的测定方法[8]

对超氧阴离子清除采用的是邻苯三酚自氧化法。

邻苯三酚可以在碱性条件下发生自身氧化生成超氧自由基（·

O2-）、以及红色中间物质。

超氧自由基能够加速邻苯三酚的氧化速率，如果有清除剂的加入，会消除·

O2-，减少了红色中间产物的积累，降低了在310nm处的吸光度。

通过测定加入多糖溶液的体系的吸光度来判断它的消除能力。

取6支干燥且干净的比色管，依次编号、分别向里面加入2.20mL蒸馏水、Tris-HCl（pH=8.20，0.05mol/L）缓冲溶液6.00mL，放在25℃的热水浴中25分钟，然后向比色管中依次加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL多糖溶液0.50mL（注：

1号管为空白对照，用蒸馏水代替多糖溶液）。

迅速加入在25℃热水浴中预热20分钟的邻苯三酚（0.7mmol/L由10mmol/L盐酸配制）1.00mL，摇匀。

放置在20℃水浴槽中反应5分钟，最后加入1.00mL的HCL（8mL/L）溶液结束反应。

将各管在310nm处测定它的吸光度，再将维生素C药片研磨，称取，配制同浓度的维生素C溶液作对比。

清除率计算：

O2-清除率=（A0-A样品）/A0×

2结果与分析

2.1干木耳粗多糖提取的条件优化及含量的测定

多糖在热水提取的过程中，有许多因素会影响多糖提取率。

本文针对浸提料液比、温度、时间这三个条件进行探究[9]。

2.1.1浸提时间对多糖提取的影响

固定温度为85℃、料液比1:

30不变。

时间为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5h，根据1.3.1方法分别测定他们的提取率，结果如下：

表2-1浸提时间对多糖提取率的影响

时间/h

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

提取率/%

4.52

6.43

9.21

10.89

12.36

14.15

13.32

11.96

由结果得出，随着时间的增大，提取率先增大后减小。

当浸提时间为3.5h，提取率最大，继续增加时间，提取率开始下降。

2.1.2浸提温度对多糖提取的影响

固定浸提时间为3.5h，料液比1:

温度为50、60、70、75、80、85、90、95℃。

根据1.3.1方法分别测定他们的提取率，结果如下：

表2-2浸提温度对多糖提取率的影响

温度/℃

50

60

70

75

80

85

90

95

3.56

8.12

9.10

10.35

13.45

14.96

16.51

16.79

由上表中数据表明，随着温度的升高，多糖的提取率也会随之增加。

但是过高温度会分解多糖，多糖的活性受到影响，所以我们选择90℃作为我们的浸提温度。

2.1.3浸提料液比对多糖提取率的影响

由表2-1、表2-2可知，固定浸提时间为3.5h，浸提温度为90℃不变。

料液比分别1:

20、1:

30、1:

40、1:

50、1:

60、1:

70。

表2-3料液比对多糖提取率的影响

料液比

1:

20

30

1;

40

1:

未完全浸没

16.53