实验方法Word格式.docx

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每个试样，应取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。

两个平行样测定值相差不得超过0.2%，否则应重做。

实验二 

饲料粗蛋白的测定

一、实验目的

通过饲料样品中粗蛋白质的测定，让学生了解了解凯氏定氮法测定的基本原理，掌握半微量凯氏定氮法测定饲料粗蛋白质的方法，掌握粗蛋白质含量的计算方法。

各种饲料的有机物质在还原性催化剂（如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉）的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。

消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，求出氮的含量，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白质的含量。

其主要化学反应如下：

1、2NH4（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2（丙氨酸）

2、（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3+3H2O+2Na2SO4

3、4H3BO3+NH3→NH4HB4O7+5H2O

4、NH4HB4O7+HCl+5H2O→NH4C1+4H3BO3

本法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。

在测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺，铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等，故以粗蛋白质表示之。

1、实验室用样品粉碎机或研钵；

2、分析筛：

孔径0.45mm（40目）；

3、分析天平：

4、消煮炉或电炉；

5、滴定管：

酸式，25或50ml；

6、凯式烧瓶：

100或500m1；

7、凯氏蔗馏装置：

常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；

8、锥形瓶，150或250m1；

9、容量瓶：

100ml。

三、实验内容

1、称取0.5～1g试样（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g，无水硫酸钾（或硫酸钠）15g，与试样混合均匀，再加硫酸25ml和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加热消化15min。

2、氨的蒸馏

（1）常量直接茂馏法将上述的试样消煮液冷却，加蒸馏水200ml，摇匀，冷却。

沿瓶壁小心加入40％氢氧化钠溶液100ml，立即与蒸馏装置相连．蒸馏装置冷凝管的末端应浸入50ml硼酸吸收液lcm。

加混合指示剂2滴，轻摇凯氏烧瓶，使溶液混匀，加热蒸馏，直至馏出液体积约150ml。

先将吸收液取下，再停止加热。

（2）半微量水蒸汽蒸馏法上述试样的消煮液冷却，加蒸馏水20m1转入100ml容量瓶，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。

取2％硼酸溶液20ml，加混合指示剂2滴，使半微量蕉馏装置的冷凝管末端浸入此溶液；

蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此液为橙红色，否则应补加少许硫酸。

准确移取试样分解液10～20ml注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40％氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，并在入口处加水封密好，防止漏气，蒸馏4min，使冷凝管末端离开吸收液面，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。

3、滴定用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L的HCI标准溶液滴定，仍以甲基红或混合甲基红为指示剂。

在测定饲料样本中含氮量的同时，应做一空白对照测定，即各种试剂的用量及操作步骤完全相同，但不加样本，这样可以校正因药品不纯所发生的误差，吸收氨后的吸收液立即用0.05mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。

4、空白测定称取蔗糖0.0lg，以代替试样，按上述测定步骤进行空白测定，消耗0.05mol/L盐酸标准溶液的体积应不得超过0.3ml。

5、计算

每m1的lmol/L盐酸标准溶液相当于0.0140g的N。

因此，

v2—试样滴定时所需酸标准溶液的体积（m1）；

v1—空白滴定时所需酸标准溶液的体积（m1）；

c—盐酸标准溶液的浓度（mol/L）；

m一试样的质量（g）；

v 

—试样的分解液总体积（ml）；

v’—试样分解液蒸馏用体积（m1）；

0.0140—每mlHCl标准溶液相当于N的克数；

6.25一氮换算成蛋白质的平均系数。

每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。

当粗蛋质含量在25％以。

上，允许相对偏差为1％；

当粗蛋白质含量在l0％～25％时，允许相对偏差为2％；

当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。

测定步骤的检验精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按测定步骤文字中的各步骤操作，并按公式计算（但不乘系数6.25），测得硫酸铵含氮量为21.19±

0.2％，否则应检查加碱，蒸馏和滴定各步骤是否正确。

试样消煮时，加入硫酸铜0.2g，无水硫酸钠2g，与试样混合均匀，再加硫酸10ml，仍可使饲料试样分解完全,只是试样焦化再变为澄清所需时间要略长些。

实验三 

饲料粗脂肪含量的测定

通过饲料样品中粗脂肪的测定，使学生掌握各类饲料样品中粗脂肪的测定原理和方法。

二、测定原理

索氏（Soxhlet）脂肪提取器中用乙醚提取试样，称提取物的重量，因除脂肪外，还有有机酸、磷脂、脂溶性维生素，叶绿素等，因而测定结果称粗脂肪或乙醚提取物。

2、分杆筛；

4、电热恒温水浴锅，室温～100℃；

5、恒温烘箱；

6、索氏脂肪提取器：

100或150ml；

7、滤纸或滤纸简：

中速，脱脂；

8、干燥器：

用氯化钙（干燥级）或变色硅胶为干燥剂。

四、实验内容

索式提取器应干燥无水。

抽提瓶（内有沸石数粒）在105±

2℃烘箱中烘干30min，干燥器中冷却30min，称重。

再烘干30min，同样冷却称重，两次称重差小于0.0008g为恒重。

称取试样1～5g，准确至0.0002g，于滤纸筒中，或用滤纸包好，放入150℃烘箱中，烘干2h（或称测水分后的干试样，折算成风干样重），滤纸筒应高于提取器虹吸管的高度，滤纸包长度应以可全部浸泡于乙醚中为准。

将滤纸筒或包放入抽提管，在抽提瓶中加无水乙醚60～100ml，在60～75℃的水浴（用蒸馏水）上加热，使乙醚回流，控制乙醚回流次数为每小时约10次，共回流约50次（含油高的试样约70次）或检查抽提管流出的乙醚瓶挥发后不留下油迹为抽提终点。

取出试样，仍用原提取器回收乙醚直至抽提瓶中乙醚几乎全部收完，取下抽提瓶，在水溶上蒸去残余乙醚。

擦净瓶外壁。

将抽提瓶放入105±

2℃烘箱中烘干1h，干燥器中冷却30min，称重，再烘干30min,，同样冷却称重，两次称重之差小于0.001g为恒重。

（％）

式中：

m—风干试样质量（g）；

m1—已恒重的抽提瓶质量（g）；

m2—己恒重的盛有脂肪的抽提瓶质量（g）。

每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。

粗脂肪含量在10％以上（含10％）时，允许相对偏差为3％；

粗脂肪含量在10％以下时，允许相对偏差为5％。

实验四 

饲料粗灰分的测定

通过饲料样品中粗灰分的测定，使学掌握粗灰分的测定原理和方法。

在550℃灼烧后所得残渣，用质量百分率表示。

残渣中主要是氧化物，盐类等矿物质，也包括混入饲料的砂石、土等，故称粗灰分。

2、分样筛，孔径0.45mm（40目）；

4、高温炉：

电加热，有高温计巳可控制炉温在550℃；

5、坩埚；

6、干燥器：

用氯化钙（干燥试剂）或变色硅胶作干燥剂。

将干净坩埚放入高温炉，在550±

2℃下灼烧30min，取出，在空气中冷却约lmin，放入干燥器冷却30min，称重。

再重复灼烧，冷却，称重，直至两次称重之差小于0.0005g为恒重。

在已恒重的坩埚中称取2～5g（灰分重0.05g以上）试样，准确至0.0002g，在电炉上小心炭化，再放人高温炉，于550±

20℃下灼烧3h，取出，在空气中冷却约1min，放入干燥器中冷却30min，称重。

再同样灼烧1h，称重，直至两次称重之差小于0.001g为恒重。

式中，m0—己恒重空均埚质量（g）；

m1—坩埚加试样质量（g）；

m2—灰化后坩埚加灰分质量（g）。

，

每个试样应取两个平行样测定，以其算术平均值为结果。

粗灰分含量在5％以上时，允许相对偏差为1％；

粗灰分量在5％以下时，允许相对偏差5%。

实验五 

饲料钙的测定

通过饲料样品中钙的测定，使学生掌握钙的测定原理和方法。

将试样中有机物破坏，钙变成溶于水的离子，用草酸铵定量沉淀，用高锰酸钾法间接测定钙的含量。

三、实验材料

2、分样筛：

4、高温炉；

电加热，可控制温度在550土20℃；

5、坩埚：

瓷质；

6、容量瓶：

100ml；

7、滴定管：

8、玻璃漏斗：

6cm直径；

9、定量滤纸：

中速，Φ7～9cm；

10、移液管：

10，20ml；

11、烧杯：

200ml；

12、凯氏烧瓶：

250或500ml。

1、试样的分解

（1）干法称取试样3～5g于坩埚中，准确至0.0002g，在电炉上小心炭化，再放入高温炉于550℃灼烧3h（或测定粗灰分后接续进行）。

在盛灰坩埚中加入盐酸溶液10m和浓硝酸数滴，小心煮沸。

将此溶液转入l00ml容量瓶，冷却至室温；

用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。

（2）湿法（用于无机物或液体饲料）

称取试样2～5g于凯氏烧瓶中，准确至0.0002g。

加入硝酸（GB326—65，化学纯）30m1，加热煮沸，至二氧化氮黄烟逸尽，冷却后加入70%～72％高氯酸（GB623—77，分析纯）10ml，小心煮沸至溶液无色。

不得蒸干（危险！

）。

冷却后加蒸馏水50ml，并煮沸驱逐二氧化氮，冷却后转入100ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。

2、试样的测定准确移取试样分解液10～20ml（含钙量20mg左右）于烧杯中，加蒸馏水100ml，甲基红指示剂2滴。

滴加氨水氨水溶液至溶液至橙色。

再加盐酸溶液使溶液变红色（pH2.5～3.0）。

小心煮沸慢慢滴加热草酸铵溶液l0ml，并不断搅拌。

如溶液变橙色，应补滴盐酸溶液至红色。

煮沸数分钟，放置过夜使沉淀陈化（或在水浴上加热2h）。

用滤纸过滤，用1：

50的氨水溶液洗沉淀6～8次，至无草酸根离子（接滤液数ml加!

加硫酸数滴，加热至80℃，再加高锰酸钾1滴，呈微红色，应0.5min不褪色）。

将沉淀和滤纸转入原烧杯，加硫酸10ml，蒸馏水50ml，加热至75～85℃，用0.05mol/L高锰酸钾滴定，溶液呈粉红色应半分钟不褪色为终点，同时进行空白溶液的测定。

V—0.05mol/L高锰酸钾标准溶液滴定用体积（ml）；

V0—测定空白时，0.05mol/L高锰酸钾标准溶液滴定用体积（ml）；

C—高锰酸钾标准溶液浓度（mol/L）；

m—试样质量（g）；

V’—滴定时移取试养分解液体积（ml）；

40/2—钙的mol数。

含钙量1%以下时，允许相对偏差3%；

含钙量1%～5%时，允许相对偏差5%；

含钙量1%以下时，允许相对偏差10%。

实验六 

饲料总磷的测定

通过饲料样品中磷的测定，使学生掌握用钼黄比色法测定饲料样品中总磷含量的原理和方法。

先将试样中有机物破坏，使磷游离出来，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理，生成黄色，（NH4）3PO4NH4VO3·

16MoO3，在波长420nm下进行比色测定。

此法测得为总含磷量，其中包括动物难以吸收的植酸磷。

4、分光光度计：

有10mm比色池，可在420nm下测吸光度；

5、高温炉：

电加热，可控制温度在550±

20℃；

6、坩埚：

7、容量瓶：

100ml或1000ml；

8、容量瓶或具塞比色管：

50ml；

9、刻度移液管：

10ml；

10、凯氏烧瓶：

250ml或500m1。

称取试样2～5g于凯氏烧瓶中，准确至0.0002g。

2、标准曲线的绘制准确移取磷标准溶液（50μg/m1）0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，15.0ml于50ml容量瓶中，各加入钒钼铵辊邑试剂10ml。

用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置10min以上。

以0ml溶液为参比，用10mm比色池，在4200m波长下，用分光光度计测各溶液的吸光度。

以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

3、样的测定准确移取试样分解液1～10ml（含磷量50—500μg）于50ml容量瓶中，加入钒钼酸铵显色试剂10ml，按上述的方法显色和比色测定，测得试样分解液的吸光度。

用标准曲线查得试样分解液的含磷量。

m 

—试样质量（g）；

V—比色测定时所移取试样分解液的体积（ml）；

X—由标准曲线查得试样分解液含磷量（μg）。

含磷量在0.5%以上时，允许相对偏差3%；

含钙量0.5%以下时，允许相对偏差10%。

实验七 

饲料盐分的测定

使学生掌握用莫尔法测定饲料中的盐分（氯）的含量的原理和方法。

在中性溶液中，C1-与CrO42-能分别与Ag+形成溶解度较小的AgCl白色沉淀和度相对较大的砖红色Ag2CrO4沉淀。

因此，在滴入AgNO3标准溶液的过程中；

只要溶液中有适量的K2CrO4，首先析出的是溶解度较小的AgCl沉淀，而当快达到等当，Ag+浓度随溶液中C1-的减少而迅速增加，当增加到Ag2CrO4沉淀所需要的Ag+浓度随溶液中c1-的减少时，便析出Ag2CrO4沉淀，使溶液呈浅砖红色，其反应式如下：

等当点前：

Ag++C1-=AgCl↓（白色）

等当点时：

2Ag++CrO42-=Ag2CrO4↓（砖红色）

瓷坩埚（25～30ml），玻棒，试管，滴定管（棕色），漏斗，容量瓶（250m1），吸管（1m1），电炉，移液管（10ml）。

精称2g左右样本于坩埚中，在电炉上小火炭化至无烟后，移入550℃高温电炉灰化至灰白色，用热蒸馏水滤入250ml容量瓶中，洗至无C1-存在为止（即取滤液2-3滴，加1滴AgNO3，至无AgCl沉淀生成）定容至刻度。

用移液管吸取滤液10ml于三角瓶中，加1％的酚酞2～3滴，用0.1NNaOH调至微红，再滴加0.1NH2SO4至刚变为无色，然后加lmll0％K2CrO4，用AgNO3标准液滴至溶液呈浅砖红色，且半分钟不褪色为止。

空白试剂除用蒸馏水10ml代替样本液外，其他同样本液测定。

N—AgNO3标准液摩尔浓度；

V1—滴定样本液消耗AgNO3的ml数；

V0—滴定空白液消耗AgNO3ml数；

W—样本重（g）。

实验八 

饲料中粗纤维的测定

使学生掌握用饲料中粗纤维的测定方法，了解粗纤维测定方法中存在问题及解决的方案。

用固定量的酸和碱，在特定条件下消煮样品，再用乙醚、乙醇除去醚溶物，经高温灼烧扣除矿物质的量，所余量称为粗纤维。

它不是一个确切的化学实体，只是在公认强制规定的条件下，测出的概略养分。

其中以纤维素为主，还有少量半纤维素和木质素。

4、电热恒温箱：

可控制温度在130℃；

电加热，可控制温度在550～600℃；

6、古氏坩埚：

30ml，预先加入30ml酸洗石棉悬浮液。

再抽干，以石棉厚度均匀，不透光为宜；

7、消煮器：

由冷凝球的高型烧杯（50ml）或有冷凝管的锥形瓶；

8、锅滤装置：

抽真空装置，吸滤瓶及漏斗；

9、滤器：

200目不锈钢网和尼龙网，或G2号玻璃滤器；

10、干燥器：

（1）称样：

称取1～2g试样，准确至0.0002g，如果脂肪<

1%可不脱脂，1~10%可不必脱脂，但建议脱脂，脂肪>

10%必须脱脂，或用测脂肪后残渣。

（2）酸煮：

加入0.255±

0.005mol/L煮沸的硫酸200ml和1滴正辛醇，使其在2min沸腾，且连续微沸30±

1min。

注意保持硫酸浓度不变，样品不可损失。

（3）过滤：

用沸蒸馏水洗至不含酸。

（4）碱煮：

将酸洗不溶物放入原容器中，加浓度准确为0.313±

0.005mol/L且已沸的氢氧化钠溶液200ml，同样微沸30min。

（5）过滤：

先用25ml0.255mol/L硫酸洗涤，再用沸蒸馏水洗至中性，用乙醇15ml洗残渣。

（6）烘干灰化：

取下坩埚，130℃烘干至恒重。

550±

25℃灼烧30min，冷却称重至恒重。

1976年VanSoet提出了中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素作为评价饲草纤维类物质的指标。

NDF：

木质素、纤维素、二氧化硅、半纤维素、细胞壁的成分如镶嵌微量的蛋白质

ADF：

木质素、纤维素、二氧化硅

ADF-NDF=半纤维素

ADF-ADL=纤维素

该法可以分别测出纤维素，半纤维素、木质素和硅酸盐，这量一大进步，但该法提取出的纤维物质中残留含氮尚有20~50%（有可能不消化），在NDF还有淀粉残留，使准确性下降，该法不适于纤维量低的精料（蛋白质或淀粉多的试样），因此也叫饲草分析方案。

Fonnesback（冯列士贝克）于1970～1974年提出冯氏法。

（1）先用蛋白酶将饲料进行消化（pH=3.5），然后用酸性洗涤剂煮沸1h，使原饲料中95%以上的蛋白质被消化。

（2）将上步分离出的细胞壁用40%硫酸煮1h，使半纤维素水解，过滤残渣为纤维素和木质素，酸不溶灰分，1步-2步=半纤维素含量。

（3）将上步所得的残渣用72%硫酸处理3h，过滤洗涤残渣，105±

2℃烘干，称重，然后灼烧称重，木质素逸失，剩余为二氧化硅。

实验九能量的测定

使学生了解了解氧弹式热量计测热的基本原理及方法。

有机物的燃烧热系单位质量有机化合物完全氧化时，所能释放出的热量，称为该物质的燃烧热，也称总能。

根据热力学第一定律，一个热化学反应，只要其开始与终末状态一定，则反应的热效应就一定。

这一原理使我们测定各种物质的燃烧热变为有意义。

有机物差不多均能氧化完全，并且反应进行很快，因此，准确地测定燃烧热就有了可能。

由所测得的燃烧热还可以计算反应的热效应和化合物的生成热。

将由消化代谢试验所用的饲料或日粮以及所收集的粪、尿样品，制备成一定质量的测定试样，装于充有（25±

5）kg·

cm-2纯氧氧弹中进行燃烧。

燃烧所产生之热量为氧弹周围已知质量的蒸馏水及热量计整个体系所吸收，并由贝克曼温度计读出水温上升的度数。

该上升的温度乘以热量计体系和水的热容量之和，即可得出试样的燃烧热。

在测定过程中一些因素会影响测定结果的准确性，须加以校正才可得出真实的热价。

例如，由于辐射的影响，水温上升的度数与由燃烧产热所致的实际升温之间有偏差；

引火丝本身燃烧的发热量；

以及含有氮、硫等元素的样品，在氧化后生成硝酸、硫酸，其发热量应予以扣除等。

1、氧弹式热量计；

2、氧气钢瓶（附氧气表）及支架；

3、容量瓶：

2000，1000，200mL；

4、量筒200，500mL；

5、滴定管50mL；

6、吸管10mL；

7、烧杯250，500mL。

1、准备工作

测定前应擦净氧弹各部污物及油渍，以防试验时发生危险，氧气钢瓶应置于阴凉安全处，并应注意避免滑倒。

（1）称量样品及引火丝的准备。

取1～1.5g风干饲料样品（经粉碎过40目筛），用压样机压成饼状，然后置于干燥洁净的坩埚中称重（准确至0.000lg）。

样品的多少依测定时温度上升不高于3～4℃为准，最好以1℃左右为宜。

如温差大时，热量计因辐射而损失的热也多，引起的误差也较大。

此外，在称量样品的同时，应测定样品的含水量，以便换算成绝干基础的热价。

量取及称重10cm的引火丝，将盛有样品的坩埚置于弹头的坩埚支架上，将引火丝固定在两个电极之上，其中一端应距样品表面1～2mm。

引火丝切勿接触坩埚。

（2）加水及充氧。

在弹头与弹体装配前，取5～10mL水注入氧弹底部，以吸收燃烧过程中产生的五氧化二氮与三氧化硫气体。

加入的水量不要求很精确，但应与测定热量计水当量相一致。

然后用螺帽将弹头与弹体扭紧，取下进气阀的螺母，拧上连接氧气瓶的气管接头，充氧之前应先打开针形阀。

先充氧约5kg·

cm2，使氧弹中空气排尽。

然后，充氧压力应逐渐增至25～30kg·

cm2。

但充氧不可过快，否则会使坩埚中的试样为气流所冲散而损失。

这一点必须注意。

（3）内外水筒的准备及热量计的安