RNA干扰 专题Word文件下载.docx

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而另外的研究还发现，在华丽新小杆线虫中，RNAi装置中，内源性编码的诱导剂，是在蛋白质合成水平发挥作用的。

2.RNAi的作用的基本过程

第一步：

起始步 

沉默触发物被裂解，产生小干扰性RNA（smallinterferingRNAs，siRNAs）。

研究表明，果蝇胚胎提取物就有将长链dsRNA底物裂解为长度在约22bp小片段的活性。

这些siRNAs是双链的，有磷酸化的5ˊ端。

这一过程，可能与RnaseⅢ家族的功能有关。

该家族中有一类已被命名为Dicer酶，含2个催化结构域、1个螺旋酶结构域和1个PAZ基序。

遗传学研究表明，Dicer酶结构在多种生物体之间比较保守。

第二步：

效应步 

siRNAs与多种亚单位形成复合物—RNA诱导的沉默复合物（RISC），然后以RISC的方式降解单链的靶mRNA。

在RISC中，这种大小约22bp的siRNAs所起的作用，是以碱基配对的原则，识别与dsRNA相同序列的靶mRNA，引导复合物中的RNA降解酶RNase，确保对特定的序列的靶mRNA进行降解。

第三步：

沉默效应的放大和扩散 

在华丽新小杆线虫中，RNAi能够扩散到整个虫体，即使只有少量的触发物dsRNA；

在植物中也发现了相似的情况，沉默效应扩散到整株植物，并可转移到嫁接的幼芽。

研究发现，西红柿中RNA指导的RNA聚合酶（RdRP）与RNAi的扩散有关；

而华丽新小杆线虫和植物中dsRNA诱导的基因沉默所需要参与的蛋白质，在序列上与西红柿的这种RdRP很相似；

在其他生物体中，起RdRP作用的分别可能是：

拟南芥属—SDE1/SGS2，脉孢菌属—QDE-1，胚系华丽新小杆线虫—EGO-1，华丽新小杆线虫成虫—RRF-1/RDE-9；

而病毒诱导的基因沉默（VIGS），则是螺旋酶。

有学者认为，沉默效应的放大和扩散，是RdRP激发了另外的dsRNA合成。

RNAi原理示意图

三、RNAi抑制病毒研究技术路线图

二RNA干扰研究前沿和应用领域

小RNA（MicroRNA，miRNA）的作用与应用研究继2001，2002连续两年被美国《Science》杂志评选为年度10大突破技术以来，2003年继续热度高涨，名列前矛。

其核心技术RNA干扰（RNAi），即用20多个核苷酸组成的短的双链ＲＮＡ（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，并为基因治疗开辟了新的途径。

近两年来，这方面的科学论文及报道爆炸性增长，几乎每天都有新的结果涌现。

此外，RNAi沉默机制的探索方面也取得了相当的进展。

在大致勾画出生物体内源性小RNA的重要作用框架后，2003年生物学家致力于阐述更进一步的细节，探索小RNA如何调控细胞的行为，如何利用RNAi机制进行疾病防治等等。

以下就分几个方面为大家介绍一些近几年RNA干扰的主要研究领域及前沿进展。

一．外源RNA诱导RNAi的应用

1.基因功能研究

　　从2001年《Nature》杂志上首家报道在哺乳动物培养细胞中通过siRNA成功诱导了特异性靶基因表达沉默后，RNA干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具从低等生物成功进军哺乳动物领域。

2003年RubinsonDA等又在NatureGenetics上报道用病毒系统在原代哺乳动物细胞，干细胞和转基因小鼠上都取得了RNA干扰成功，更大大扩展了这项技术的应用范围。

研究者们可以利用这项技术对目标基因进行特异性地表达沉默，通过观察其表达被抑制后细胞以至生物体从形态到各项生理生化的变化，对该基因的功能及参与的信号网络进行研究。

这比传统的基因敲除方法要简单而且方便得多，因此短短几年，就有了很多突破性的成果。

其中研究得最多的是跟疾病相关的一些基因，不仅对疾病机制及相关代谢网络有了进一步认识，也为基因治疗及药物筛选提供了一些借鉴。

　　在具体诱导方式方面，目前报道的成功的siRNA形式多样，其中短发夹结构RNA（shRNA，shorthairpinRNA）表达载体的应用大大加快了研究者从最初的培养细胞水平扩展到成体水平的步伐。

例如，在神经生物学研究中，美国NIH的BackmanC等通过siRNA表达质粒对中脑腹侧神经细胞中的多巴胺能相关基因进行了有效抑制，HommelJD等还通过病毒介导的RNAi建立了此类成年小鼠模型，不仅为建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记，对神经系统的基因治疗也有一定借鉴意义；

在癌症研究中，ZhangY等也通过shRNA表达载体成功抑制成年大鼠脑癌基因，并对RNAi的远程（穿过血脑屏障）基因沉默方法进行了非常有益的探索；

利用细胞凋亡途径，ZenderL等通过RNAi抑制凋亡基因Caspase－8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率，并发现Caspase8siRNA处理对特异性Fas激活剂（Jo2和AdFasL）和野生型腺病毒介导的急性肝功能衰竭都有效，表明这个动物模型能反应人类急性病毒肝炎多分子参与的机制，增强了siRNA用于急性肝炎病人治疗的希望……

除了对某些关键基因的RNAi研究外，ZhengL等还在哺乳动物细胞中探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法。

他们建立了一个包含8000多个基因的siRNA表达框文库阵列，通过它来高通量筛选NF-kB信号途径中已知的及Unique基因。

由此可见，RNA干扰也正作为筛选成百甚至上千基因的工具，发挥着越来越大的作用。

　　总的来说，RNA干扰为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。

通过在一段时间内对一个基因RNA信号的抑制，研究者可以深入研究基因功能，进而开始描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络。

2.基因治疗及药物筛选探索

　　由于RNA干扰是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，且作用迅速，效果明显，为基因治疗开辟了新的途径。

其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制，控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。

尤其针对引起一些对人类健康严重危害的核酸病毒，如去年在全球多个国家和地区流行的SARS这种主体是单链核酸的新型冠状病毒，寻找药物靶点，设计核酸药物就更加方便。

目前已经有很多公司在积极开发这方面的药物，如在去年SARS药物研究中一鸣惊人的美国俄勒冈州的AVIBioPharma生物制药公司等。

国内也有很多研究机构及生物技术公司投入了这方面的工作。

如上海生科院成立了SARS防治科研攻关领导小组，其中生化细胞所和药物所的一些课题组在从RNA干扰的角度努力。

此外，北大，中南大学，北京动物所等大专院校研究机构以及北京金赛狮反义核酸技术开发有限公司等也开展了RNA干扰药物的研究与开发。

基因治疗方面去年最引人注目的进展之一是对肝炎的RNA干扰研究。

McCaffreyAP等通过表达shRNA的载体在培养细胞水平和转染HBV质粒后免疫活性缺失的小鼠肝脏中成功抑制了HBV复制。

与对照相比，小鼠血清中测得的HBsAg下降84.5％，免疫组化对HBcAg的分析结果下降率更超过99%。

另，哈佛大学Lieberman的研究小组通过注射针对Fas的siRNA，过度激活炎症反应，诱导小鼠肝细胞自身混乱。

然后给测试小鼠注入使Fashyperdrive的抗体，发现未进行siRNA处理的对照组小鼠在几天中死于急性肝功能衰竭，而82%的siRNA处理小鼠都存活下来，没有患病，它们当中80-90％的肝细胞经证实结合了siRNA。

并且，RNAi发挥功能达10天，三周后才完全衰退。

由于Fas很少在肝细胞外的其它细胞高表达水平，对它的抑制对其它器官几乎没有副作用。

此外，这个小组还和其它研究者积极开展针对HIV的RNAi测试，目前报道他们使用的针对CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV进入免疫细胞约三周，在已经感染的细胞中也能阻止感染病毒的复制。

　　然而，尽管取得了不少成果，要真正用于医疗还需时日。

目前大多数还停留在小鼠测试阶段，siRNA的导入多采用静脉或腹腔注射，尾部注射，细胞移植等，如何对人进行有效的给药，既能确保药效在靶器官靶组织有效释放，还要具有高度安全性等等问题都尚需进一步研究。

我们期待着RNAi引领的新医学革命的到来。

在药物筛选领域，除了线虫这种低等动物的RNAi高通量药筛模式外，2003年LaveryKS等的综述中也对RNAi在药筛领域的应用前景进行了高度评价：

RNAi技术将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具。

他对如何在药筛的各个阶段应用RNAi做了具体描述及展望，并指出将这项技术与高通量筛选，体外生物检测和体内疾病模式相结合，将提供大量基因功能方面的有用信息，在药物开发过程的多个阶段促进靶点的筛选。

二．内源RNAi机制及功能研究

　　是什么原因使我们有可能通过外源siRNA诱导内源性的靶基因转录后沉默？

为解开这个迷题，更有效地进行RNAi应用，随着RNAi应用研究的广泛开展，生物体内部RNAi机制研究也愈加深入，并迅速成为RNAi研究中的重要领域，吸引着越来越多的研究者投身其中，涌现出一系列令人耳目一新的成果

多年来，生物学家认为RNA在生命过程中的作用仅仅是将遗传信息从DNA传递到蛋白，就象蜂群中的雄蜂般没有创意。

但近几年的一系列发现使研究者对RNA，尤其是mRNA以外的哪些小RNA的功能有了全新的认识。

生物体中有一群小RNA（目前看来人体中编码约255种小RNA，竟占整个基因组近1%，很多可能编码自以前被认为“垃圾DNA”的区域），它们也可通过自身的RNAi机制，在生命过程的各个阶段关闭或调控基因表达水平，从而控制细胞的多种生命活动。

尤其在发育过程中2003年有一些激动人心的最新发现：

仅约22个核苷酸长度的小RNA，发现竟能引导早期发育――从使植物叶片成形到介导果蝇胚胎在植物组织中的细胞增殖；

缺少RNAi蛋白Dicer（一种RNA酶III家族的酶，参与RNAi过程中对RNA的剪切）的小鼠会缺少干细胞的某些分化系（swathsofstemcells），在出生前就夭折；

小鼠中特定的小RNA能帮助引导干细胞生成胚胎的血细胞系统。

　　此外，有些RNAi现象能在DNA编码不变的情况下传代，甚至在一些物种中对基因组进行调整，有人形象地比喻它为“引导基因组的手”，生动体现了小RNA源于基因组但对基因组所具有的强大反馈作用。

《Science》上一篇题为“RNAiExtendsItsReach”的综述详细阐述了RNAi途径已经不仅仅限于沉默mRNA，还作用于基因组。

这方面的具体机制还不是非常明确，但在植物中发现伴随有DNA甲基化现象，科学家们预测要描绘一张完整的RNA引导基因组改变的图谱可能需要对RNA信号，DNA甲基化和组蛋白修饰之间的相互作用进行更进一步的研究。

综合来看，我们可将目前报道的内部RNAi机制可能的功能，大致分为以下几类：

1.抗病毒功能

　　Voinnet和Li等分别在植物和果蝇中发现了通过RNAi实现的抗外源核酸机制：

被大多数RNA病毒启动的RNAi可导致病毒基因组降解。

例如在果蝇细胞中，Flockhousevirus（FHV）就能引发果蝇内部的RNAi反应，产生FHV特异性的siRNA来降解感染的FHV。

2.基因调控

　　目前在人、蠕虫，果蝇和植物等生物体中都发现了小RNA，有的通过结合3'

非翻译区（UTR）和靶mRNA抑制mRNA翻译，有的作为siRNA通过RNAi机制破坏靶基因转录本，对基因表达水平进行调控。

3.染色质浓缩

　　内源的siRNA，一些小RNA可能通过使染色质浓缩调节基因表达。

一些研究小组发现dsRNA结合到植物启动子区域能通过一种使DNA甲基化的作用导致基因沉默；

在蠕虫体内检测到许多Polycomb蛋白（能结合染色质）是RNAi过程所必须的；

裂殖酵母中内源siRNA可介导中心粒区染色质浓缩，导致这个位点的基因转录沉默。

如VeraSchramke等在裂殖酵母中通过合成shRNA反式抑制同源位点，导致在mate区沉默的Swi6染色质浓缩。

这些结果都提示一些内源性的siRNA通过导致染色质浓缩来调节基因水平。

4.转座子沉默

　　目前，两方面的证据提示转座子沉默涉及siRNA。

其一，发现蠕虫mut-7基因参与RNAi和转位抑制。

其二，从裂殖酵母的中心粒区也分离出siRNA，并检测到这些siRNA介导此区内组蛋白甲基化。

由于中心粒区包含重复序列――含转座子片段，在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座子LTR（长末端重复序列）介导的RNAi，推测在siRNA介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古老的转座子沉默作用。

5.基因组重组

　　siRNA可能参与纤毛虫，四膜虫虫体间结合时的基因重组。

结合到重组序列的siRNA，在虫体之间的结合过程中介导DNA缺失和染色体断裂。

有趣的是，在这些siRNA介导的程序性DNA删除事件中，也发现需要重组区域组蛋白的甲基化。

　　结语：

RNAi的确有太多的值得研究的领域和值得期待的发现，我们真诚地希望中国科学界能在探索小RNA世界的潮流中占据令人瞩目的一席。

三、RNAi技术路线选择及应用

近年来的研究表明，一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAinterference，RNAi）。

siRNA（smallinterferingRNAs）就是这种短片断双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA。

RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。

现在越来越多的研究人员开始采用RNAi来研究生物体的基因表达。

RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。

RNAi研究的一般技术路线是：

由上述的路线可以看出，获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步，而转染的效率则是非常关键的因素。

一、siRNA的设计

　　在制备siRNA前都需要单独设计siRNA序列。

研究发现对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3‘端有两个突出碱基的双链RNA；

而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。

siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

选择siRNA靶位点：

　　从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。

有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。

Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'

和3'

端的非编码区（untranslatedregions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

序列同源性分析:

　　将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。

例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成。

并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。

通常来说，每个目标序列设计3—4对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。

设计阴性对照：

　　一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。

通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。

当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。

此外网上提供免费的siRNA设计工具 

二、siRNA的获得

1.化学合成定制siRNA 

　　尽管化学合成siRNA是最贵的方法，但却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作就可以拿到高质量的siRNA。

如QIAGEN-Xeragon公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA（可带标记）。

它最适用于的情况是：

已经找到最有效的siRNA序列，需要大量siRNA进行研究。

QIAGEN还提供siRNA设计合成一体化服务“4-forSilencingsiRNAduplexes”：

针对客户给出的一个基因序列，由QIAGEN的专家设计并合成4对siRNA，HPP纯度，保证至少一对抑制效率达到70%以上，如果达不到，免费为客户另行设计合成另外4对siRNA。

Figure1.HeLa-S3cellswereplatedoutin24-wellplatesatadensityof6x104cellsineachwell,24hoursaftertransfection.CellsweretransfectedwithlaminA/CsiRNAusingthetransfectionreagentsindicated,accordingtothemanufacturer’sprotocol.mRNAwaspurifiedfromthecells48hoursaftertransfectionandquantitativeRT-PCRwasperformedusingtheQuantiTectSYBRGreenRT-PCRKitwithprimerstargetedtolamin 

2.体外转录法合成siRNA

长链dsRNA合成

　　如果研究对象不是哺乳动物细胞，可以采用较长的双链RNA诱导RNAi现象。

我们可以DNAOligo为模版，通过体外转录合成dsRNAs，成本相对化学合成法而言比较低。

目前市场上有很多这样的体外转录试剂盒，像NEB，EPICENTRE都提供类似的试剂盒。

特异性siRNA合成

　　多数生物尤其是哺乳动物，siRNA仍是诱导RNAi的最佳选择。

以DNAOligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。

值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，一般只需化学合成的siRNA量的1/10就可以达到同等的效果。

这类方法主要适用于：

筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，以及化学合成的价格成为障碍时。

EpicentreMessageMuter™shRNAiProductionKit能高效地合成特异shRNA直接用于转染细胞，详见本刊“Epicentre最新的转录专家”介绍。

非特异性siRNA合成

　　特异性制备siRNA的方法的不足，是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。

而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。

这个方法通常选择200—1000碱基的靶mRNA模板，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，然后用RNaseIII（或Dicer）（大肠杆菌RNaseIII是一种识别双链RNA的内切酶，产物为3’端外悬2-3个碱基的双链短片段）在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。

在除掉没有被消化的长链dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，转染方法和特异性siRNA一样。

由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。

NEB公司的ShortCut™RNAiKit，就是采用此类方法的试剂盒。

非特异性siRNA合成，尽管特异性不强，无法确知有效靶片段，但相对经济，基因沉默效率高；

可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。

不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因沉默。

3．siRNA表达载体

　　化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：

siRNA进入细胞后容易被降解；

进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。

针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。

该方法的基本思路是：

将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。

这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。

通过质粒表达siRNAs大都是用PolIII启动子启动编码shRNA（smallhairpinRNA）的序列。

选用PolIII启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。

当这种带有PolIII启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。

采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。

当然还有