探讨改良线栓对局灶脑缺血模型制备的影响.docx

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探讨改良线栓对局灶脑缺血模型制备的影响

探讨改良线栓对局灶脑缺血模型制备的影响

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

【摘要】目的：

探讨改良线栓对局灶脑缺血模型制备的影响，评价该模型的稳定性和可靠性.方法：

雄性Wistar大鼠40只随机分为常规线栓组和改良线栓组，每组20只.线栓法制备右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）致局灶脑缺血模型.观察改良线栓对总体手术时间、术中颈总动脉血流阻断时间、线栓误入翼腭动脉（PPA）几率（PPA误栓率）和模型成功率的影响，并通过神经行为学评分、红四氮唑（TTC）染色和磁共振检测等方法评价该模型的稳定性和可靠性.结果：

改良线栓组比常规线栓组总体手术时间和术中颈总动脉血流阻断时间明显缩短，线栓误入PPA的几率降低，模型成功率高，稳定可靠.结论：

改良线栓可增加模型成功率，提高局灶脑缺血模型的稳定性和可靠性.

【关键词】脑缺血；疾病模型，动物；缝合技术；大脑中动脉闭塞；大鼠

　【Abstract】AIM:

Toinvestigatetheapplicationofmodifiedsutureinpreparationofratmodeloffocalcerebralischemiaandtoevaluatethestabilityandreliabilityofthemodel.METHODS:

40Wistarmaleratswererandomizedintotheconventionalsuturegroupandthemodifiedsuturegroup,with20ineachgroup.ThefocalcerebralischemiabyMCAOwasinducedaccordingtoLongassuturemethod.Theeffectsoftheapplicationofmodifiedsutureonthetotaloperationtime,thecommoncarotidarterybloodocclusiontimeduringthecourseofoperation,theprobabilitythatsutureenteredthepterygopalatineartery（PPA）andthesuccessratewereobserved.Andthestabilityandthereliabilityofthemodelwereevaluatedbyneurologicaldeficitscore,magneticresonanceimage,triphenyltetrazoliumchloride（TTC）staininginallrats.RESULTS:

Thetotaloperationtimeandthecommoncarotidarterybloodocclusiontimeinthemodifiedsuturegroupwereobviouslyshorterthanthoseintheconventionalsuturegroup.AndtheapplicationofmodifiedsutureinthemodelcutdowntheprobabilitythatthesutureenteredPPA,andincreasedthesuccessrate,thestabilityandthereliabilityofthemodel.CONCLUSION：

Theapplicationofmodifiedsuturecouldimprovethesuccessrate,thestabilityandthereliabilityoftheratfocalcerebralischemiainducedbyMCAO.

【Keywords】brainischemia;diseasemodels,animal;suturetechniques;middlecerebralarteryocclusion;rats

　　0引言

　　大鼠的基因与人类的基因具有98%的同源性，其脑血管结构与人类非常相似，血管闭塞后缺血范围恒定、重复性好.因此，众多有关脑缺血的研究均选用大鼠来制备模型［1-2］.制备大鼠局灶脑缺血模型的方法较多，但以线拴法应用最广.线栓法制备局灶脑缺血模型目前还存在某些不足，如线栓插入困难，栓塞成功率不高，梗塞体积不稳定等［3］.这与线栓直径、弧度以及术中颈总动脉血流阻断时间等因素密切相关.本研究重在对线栓弧度进行改良，观察改良线栓对局灶脑缺血模型的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康雄性Wistar大鼠40只，体质量220～250g，8～10wk龄，购自重庆医科大学实验动物中心，适应性喂养1wk后，随机分为常规线栓组和改良线栓组，每组20只.

　　选用“贵花田”牌鱼线，直径0.23～0.26mm，参照Ma等［4］的方法略加修改，制备改良线栓.先将鱼线剪成3cm长的小段，60～70℃加热2h将鱼线小段塑呈弧形，弧形外切角为30°时最佳，可确保线栓弧度与大鼠颈内动脉走行一致.自然冷却后，头端约5mm涂上聚胺酯，用油性记号笔在线栓头端和距头端约2cm处作上标记，以方便植入线栓时调整线栓方向，了解线栓进入血管的长度.制备常规线栓时，除不进行加热塑型外，其余步骤相同.制备好的线栓头端向上，垂直插在海绵垫上，风干，紫外线消毒后备用.使用前在生理盐水配制的肝素钠（6250u/mL）溶液中浸渍可用.

　　1.2方法参照Longa等［5］和罗勇等［6］报道的方法，采用经颈内动脉线栓法制备大鼠右侧MCAO致局灶性永久性脑缺血模型.35g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，颈前区备皮、消毒.取颈正中切口逐层切开皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露右侧颈总动脉（commoncarotidartery，CCA），颈内动脉（internalcarotidartery，ICA）和颈外动脉（externalcarotidartery，ECA），探查颈外动脉在颈部发出第一分支（甲状颈干）处，在其远心端（偏嘴侧）约0.2cm处结扎并切断ECA，确保ECA残端长度不短于0.5cm；游离、凝闭并切断ECA与ICA之间的交通支.用蛙心夹暂时阻断CCA及ICA血流，用11号手术尖刀于ECA残端作一纵行小切口，将线栓从右侧ECA残端插入ICA；轻轻牵拉ECA残端，使其与ICA成一条直线，调整线栓角度，使改良线栓弧度水平向外，与颈前正中线呈45°水平向外的夹角，移去夹闭ICA的蛙心夹，轻轻将线栓送入颅内.从CCA分叉处送入ICA约1.9～2.1cm时通常可遇阻力，且大鼠呼吸、心跳突然加快，部分大鼠尿失禁，借此可作为大脑中动脉起始处栓塞成功的标志.若不能顺利将线栓送入颅内，可再度调整线栓与ICA的角度，或再夹闭ICA更换线栓；若线栓插入过程中，线栓进入血管内的长度小于1.5cm即遇阻力（通常为1cm左右），同时大鼠出现轻微的右侧面肌抽动，提示线栓误入翼腭动脉（pterygopalatineartery，PPA），须拔线栓至ECA残端，再度调整线栓角度，重新插入.栓塞成功后，用丝线结扎ECA残端，移去夹闭CCA的蛙心夹，观察无活动性出血后关闭切口.

　　1.2.1神经行为学评分造模后3h，进行Longa法神经功能缺损评分［5］，评判模型成功与否.评分为1～4分者为成功模型.造模后12h，再根据Longa评分综合评定各组大鼠损伤程度，并进行统计分析.

　　1.2.2磁共振（MRI）检查和红四氮唑（TTC）染色采用TOSHIBAVISART1.5T超导磁共振成像机，膝正交线圈（QD）.于MCAO后12h（行神经行为学评分后）再次麻醉，仰卧位固定，行头颅T2WI检查.

　　各组大鼠在MCAO后12h行MRI检查后，深麻醉，断头取脑，将大脑整体标本置于20g/LTTC溶液中37℃孵育30min，可见边界清楚的脑梗死灶.用数码相机拍照后，再将大脑置于-20℃冰箱中快速冷冻15min，以视交叉平面为中心连续冠状切片5张，厚度5mm，重复上述染色约30min，可在冠状位见白色梗死灶.将脑片置入40g/L多聚甲醛溶液中固定过夜，用数码相机拍照.经电脑图像分析量化脑梗死绝对体积占对侧大脑半球体积的百分比，即相对脑梗死体积.

　　统计学处理：

Longa评分以等级资料表示，采用秩和检验；率的比较采用χ2检验；计量数据用x±s表示，行t检验.采用SPSS10.0统计软件包进行统计分析.检验水准α=0.05，以P0.05为差异具有显著性意义.

2结果

　　2.1手术评估动物麻醉固定后，常规线栓组通常需要（28.6±10.1）min，而改良线栓组一般只需（16.3±3.8）min即可顺利完成手术.两组总体手术时间差异显著（t=2.97，P0.01）.改良线栓组术中CCA血流阻断时间为（384.8±165.7）s，明显比常规线栓组（669.2±170.1）s缩短（t=4.31，P0.01）；改良线栓组线栓PPA误入率（13.0%）明显低于常规线栓组（30.6%），差异具有显著性（P0.05）；模型成功率改良线栓组（95%）远高于常规线栓组（85%），差异具有显著性（P0.05）.提示改良线栓可明显缩短总体手术时间和术中CCA血流阻断时间，减少线栓误入PPA的次数，明显提高模型成功率.

　　2.2神经行为学评分造模后12h，根据Longa评分综合评定各组大鼠损伤程度，改良线栓组模型大鼠Longa评分大多数为3分，而常规线栓组得分比较分散（表1）.经秩和检验，两组差异具有显著性意义（P0.05）.提示改良线栓制备的局灶脑缺血模型损伤程度相近，稳定性较好.

　　表1两组神经行为学评分（略）

　　aP0.05vs常规线栓.

　　2.2.1脑梗死体积造模后12h，MRI成像及TTC染色所显示脑梗死病灶（呈白色）范围一致，主要累及右侧大脑中动脉供血区的皮质和皮质下白质和纹状体.全脑TTC染色显示右侧大部分大脑皮质已梗死（呈白色），仅残存额极、颞极、部分枕叶和靠近中线的部分顶叶.由T2WI测得的相对脑梗死体积改良线栓组（69.6±0.6）%比常规线栓组（68.6±0.6）%稍有增加，但差异无显著性（P0.05）.TTC染色所计算的脑梗死相对体积与MRI所测结果相一致（图1）.

　　（A：

MRIT2相冠状位最大梗死层面；B：

TTC染色冠状位最大梗死层面；C：

MRIT2相水平位最大梗死层面；D：

全脑TTC染色显示脑梗死范围）.

　　图1MRI扫描和TTC染色显示改良线栓组脑梗死病灶（略）

　　3讨论

　　1986年Koizumi等［7］首次采用线栓法成功制备大鼠大脑中动脉闭塞致局灶脑缺血模型.此后Longa等对线栓法进行了适当改进，被广泛用于实验性局灶脑缺血,包括局灶脑缺血/再灌注损伤的研究［7-8］.目前，Koizumi法和Longa法已成为线栓法制备局灶脑缺血模型的经典方法.线栓法制作大鼠局灶脑缺血模型的机理是用线栓