Lu 淋巴细胞体外增殖功能检测.pptx

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实验六淋巴细胞功能检测T淋巴细胞增殖活化医学免疫学实验一些物质能够特异性或非特异性地诱导淋巴细胞发生活化，导致细胞因子的分泌、细胞因子受体的表达并最终使活化的淋巴细胞发生增殖和分化体内外激活T/B细胞增殖的物质非特异性免疫刺激剂如超抗原、丝裂原、抗体类如抗CD3抗体、促细胞生长因子如IL-2特异性抗原体内外激活T/B细胞增殖的物质普通蛋白质抗原通过与MHC-II类分子的抗原结合槽以外的非多态区（APC）和TCR-VCDR外侧区域T细胞）结合，激活2%-20%的T克隆。

比较超抗原和普通抗原与MHC及TCR的作用模式作用特点：

强激活T细胞作用（低浓度（1-10ng/ml）、多克隆（2%-20%）；不需常规的细胞内抗原提呈；不受MHC限制效应：

普通蛋白质抗原可激活总T细胞库1/1041/106大量细胞因子，病理生理过程的发生发展（similartosepticshock）T细胞超抗原（superantigen,SAg）常见的T细胞超抗原外源性细菌毒素性产物：

金黄色葡萄球菌肠毒素AE（SEASEE）、A族链球菌M蛋白、致热外毒素、关节支原体丝裂原MAM内源性小鼠乳腺肿瘤病毒蛋白MMTV次要淋巴细胞刺激抗原（mls）丝裂原名称来源特征刀豆蛋白A（ConA）刀豆活化人和小鼠T细胞植物血凝素（PHA）云豆活化人和小鼠T细胞美洲商陆丝裂原（PWM）美洲商陆激活人和小鼠T和B细胞脂多糖（LPS）G-菌测定小鼠B细胞葡萄球菌蛋白A（SPA）G+菌检测人B细胞常用有丝分裂原-激活某一类淋巴细胞的全部克隆高浓度时，经丝裂原受体与B细胞结合，多克隆诱导B细胞增殖和分化；低浓度时，BCR特异性识别TI-1抗原的B细胞能竞争结合到足够抗原量被激活；感染初期（在TD-Ag免疫应答启动前）快速产生特异性抗体静止淋巴细胞受一定物质刺激后向淋巴母细胞转化，细胞内蛋白质和核酸合成，细胞代谢旺盛，伴有数量和形态学改变，如细胞变大、胞浆增多并形成空泡、核仁明显、染色质疏松淋巴细胞增殖实验就是根据上述细胞的改变，设计的相应检测方法，又称为淋巴细胞转化实验（lymphocytetransformationtest,LTT）淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖实验淋巴细胞转化率的高低可直接反应机体T或B细胞的免疫水平，常作为检测免疫细胞功能的指标之一评价动物免疫细胞免疫应答能力的简便可靠的方法之一细胞计数法DNA合成检测法细胞代谢活性检测法细胞染色法淋巴细胞增殖功能测定台盼蓝拒染实验脾细胞计数为例10倍稀释脾细胞悬液取脾细胞悬液uLPBSuL，混匀（X稀释）X脾细胞悬液uL-台盼蓝溶液uL计数板计数脾细胞Hemacytometer每0.1mm3体积平均细胞数=四个小方格中细胞总数4每毫升细胞总数=每0.1mm3体积平均细胞数104一个小鼠脾脏单个核细胞数=每毫升细胞总数x稀释倍数x细胞悬液体积生存率（%）=（1个小方格中活细胞总数1个小方格中细胞总数）100CornersquareDNA合成检测法RNA转录、蛋白合成为DNA复制做准备DNA合成期增殖期的细胞需要大量核苷酸DNA复制完成、蛋白合成，为有丝分裂作准备利用在细胞培养过程中掺入放射性（如3H-Tdr掺入法）或非放射性的核苷类似物（如Brdu掺入实验），直接检测DNA合成水平变化3H-Tdr掺入法：

敏感但有放射性污染BrdU掺入法：

BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶DNA合成检测法G0/G1G2/MSDNA含量2倍体4倍体DNA复制完成两者之间S期细胞DNA合成检测法3H-Tdr掺入法同位素检测，敏感但有放射性污染BrdU掺入法BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物替代胸腺嘧啶，通过ELISA和流式细胞术检测竞争掺入单链DNA核苷酸序列的BrdU水平LPS3DMedium2D12.055.770.65dU7AADFlowcytometricanalysisofDNAcontent（propidiumiodide）andDNAsynthesis（BrdU）aftertwoorthreedaysofstimulation利用荧光染色可穿透细胞膜的特性染色细胞，当细胞分裂时，荧光标记物被平均分配到两个子代细胞中，其荧光强度是亲代细胞的一半，如CFSE染色细胞细胞染色法C3Heanti-u10通过活细胞线粒体脱氢酶具有转化四氮唑盐等物质的能力进而反映细胞活力的方法，如MTT法检测细胞内线粒体活性实验细胞代谢活性检测法CCK8（CellCountingKit-8）检测细胞增殖CCK-8试剂中含有2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐（WST8），它在电子耦合剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。

生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。

OD450可间接反映活细胞数量。

该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

CCK8法与其他细胞增殖检测法的优势检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水溶性差（需有机溶剂溶解再检测）好好好产品性状粉末2瓶溶液溶液溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm细胞毒性高，细胞形态完全消失很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷ConA刺激T细胞增殖淋巴细胞在体内外接受ConA刺激后，静止淋巴细胞向母细胞转化。

这种转化的细胞DNA合成增加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等形态变化。

刺激后Day0:

Day3:

刺激淋巴细胞增殖CCk8检测细胞增殖将细胞浓度分别调节为2x106/mL和4x106/mL，加入96孔板，每孔90L，加入25g/mL或50g/mLConA溶液10L，细胞培养箱（37，5%CO2）中孵育72h。

培养期间可观察细胞增殖情况。

2.5gml未刺激组调零孔5gml2ml4mlD3CCK8检测每孔（调零孔、未刺激组、刺激组）加入10LCCK8溶液，将培养板在培养箱内孵育2小时，用酶标仪测定在450nm处吸光度。

实验材料小鼠75%酒精PBS缓冲液（PH7.4）红细胞裂解液RPMI-1640不完全培养液、胎牛血清刀豆蛋白ACCK8检测试剂盒眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管血球计数板、计数器、正置显微镜、倒置显微镜微量移液器、枪头离心机酶标仪实验结果调零组未刺激组ConA5ug/mlConA2.5ug/ml2x106/ml0.2310.26850.2690.26190.2690.28510.32030.26864x106/ml0.22760.31710.34070.3220.3330.44450.47870.52820.08950.11310.09440.10540.21690.25110.3006注意事项脾脏单核细胞分离过程中严格无菌操作。

红细胞裂解时间不要过长，以免破坏其他细胞。

选择合适细胞培养浓度，及ConA刺激浓度。

酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰。

CCK8加入时，注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。

CCK8细胞毒性非常低，因此加入CCK8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。

如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。

当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。