透景公司HPV培训.ppt

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HPVHPV分型检测分型检测分型检测分型检测（流式荧光法（流式荧光法）李哲峰李哲峰2009.1.1Contents12345市场上检测HPV的方法有哪些？

HPV是什么？

为什么要分型检测HPV？

透景液芯产品HPV检测法简介。

透景生命科技有限公司简介。

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HPVHPV是一种病毒，在人和动物中广泛分布，主要侵袭人和动物的上皮组织。

HPV病毒病毒HPV感染是当前发病率最高的性传播疾病之一，可以引起包括外生殖器尖外生殖器尖锐湿疣锐湿疣、宫颈上皮内瘤样宫颈上皮内瘤样病变病变及宫颈癌宫颈癌等多种生殖系统疾病。

解读解读HPV的结构的结构v无包膜微小DNA病毒v二十面体对称结构v表面有72个壳体病毒DNA主要衣壳蛋白次要衣壳蛋白HPV的感染途径的感染途径v直接性接触传染直接性接触传染v母婴传染母婴传染v间接物体传染间接物体传染v自体接种自体接种HPV感染的特点感染的特点病毒基因组以附加体的形式潜伏于基底层细胞；病毒的复制依赖于上皮细胞的分化，在基底层上层细胞中开始复制，病毒的存在使细胞的形态学发生改变,包括多发性乳头瘤病、角化不全等。

子代病毒在脱落细胞中释放。

HPV的分类与分型的分类与分型v根据感染的部位分为v根据与宫颈癌相关性的高低进行分类l皮肤型l生殖器类型l低危型：

6、11、40、42等l高危型：

16、18、31、33等HPV感染与宫颈癌的发生发展感染与宫颈癌的发生发展出现出现HPV相关的细胞学改变相关的细胞学改变正常宫颈正常宫颈高度高度鳞状上皮内病变鳞状上皮内病变（HSIL,CINII,III/CIS）宫颈浸润癌宫颈浸润癌HPV感染感染高危高危HPV亚型亚型协同致癌因素协同致癌因素约60%在2到3年内自然逆转30%-70%在10年内演变为低度低度鳞状上皮内病变鳞状上皮内病变（LSIL,CINI）约15%在3-4年内演变为宫颈癌演进过程HPV与宫颈癌筛查与宫颈癌筛查1995年，国际癌症研究机构（IARC）专题讨论会通过HPV感染是宫颈癌的主要原因，即HPV感染是宫颈癌发生的必要条件必要条件。

2005年，IARC/WHO推荐HPV检测应用于宫颈癌筛查。

权威组织一致推荐：

采用细胞学检查和HPVDNA联检进行宫颈癌筛查。

宫颈癌筛查方法宫颈癌筛查方法v细胞学细胞学传统巴氏细胞学涂片液基细胞学（liquid-basedcytology）细胞学自动阅片系统（PAPNET，AutoPap）v肉眼法肉眼法（visualinspection）（visualinspection）醋酸白试验：

用3%5%的冰醋酸染色，简称VIA（visualinspectionwithaceticacid）碘黄试验：

用4%5%的碘液染色，简称VILI（visualinspectionwithLugolsiodine）v阴道镜检查阴道镜检查（Colposcopy）（Colposcopy）v病原学检测病原学检测免疫学免疫学HPVDNAHPVDNA检测检测HPV分型检测与宫颈癌筛查分型检测与宫颈癌筛查宫颈癌筛查推荐方案推荐宫颈癌筛查推荐方案推荐最理想筛查宫颈癌筛查方案最理想筛查宫颈癌筛查方案引自：

宫颈癌筛查及早诊早治方案/乔友林等.2003.7宫颈癌筛查方案推荐宫颈癌筛查方案推荐理想筛查方案理想筛查方案宫颈癌筛查方案推荐宫颈癌筛查方案推荐经济筛查方案经济筛查方案宫颈癌筛查手段的发展宫颈癌筛查手段的发展（细胞学）细胞学）液芯HPVDNA分型检测液基薄层巴氏涂片法醋酸白法、碘黄试验LCTTCT巴氏涂片肉眼观察传统的手工方法（巴氏涂片）传统的手工方法（巴氏涂片）v由希腊医生Papanicolaou（巴氏）发明，于20世纪40年代开始用于宫颈癌筛查。

因其方法简便，患者无痛苦，且成本较低，非常适合大范围人群的普查，至今沿用了近半个世纪，有些地方仍然在使用。

方法：

由妇产科医生用一个软木刮板，在宫颈处轻轻刮取采集脱落细胞，涂抹在载玻片上，经过染色处理后，由病理医生在显微镜下观察作出诊断。

缺点：

假阴性率即误诊率较高。

LCT、TCT液基薄层细胞学检测液基薄层细胞学检测v由于传统涂片漏诊率高，除去人眼工作疲劳及所涂细胞不在一个层次而影响诊断外，涂片上存在着大量的红细胞、白细胞、黏液及脱落坏死组织等而影响正确诊断。

所以，细胞工程专家近年又推出了一种新技术液基薄层细胞学。

目前国内主要有LCT和TCT两种方式，这是制片技术的重大革新，即通过技术处理去掉涂片上的杂质，直接制成观察清晰的薄层涂片，使阅片者更容易观察，其诊断准确性比传统法高。

ThinPrepCytologictest（TCT）liquid-basedcytologictest（LCT）液基细胞学涂片液基细胞学涂片HPV（-）阴道镜检查阴道镜检查v当宫颈细胞学涂片检查发现异常时，就需做阴道镜检查以确定病变，必要时取若干块组织送病理检查，为手术治疗提供依据。

宫颈锥形切除术宫颈锥形切除术v当宫颈细胞刮片检查多次为阳性，而多点活检及颈管刮术阴性，或已证明为原位癌，不能排除浸润癌者，可行宫颈锥切术并送病理。

此种方法即达到诊断的目的又将病灶一并切除，被认为是一举两得的方法。

因锥切术后有不同程度的并发症，目前在临床多不采用，如果作为治疗手术可以全子宫切除术取代。

宫颈癌筛查手段的发展（病原学检测）宫颈癌筛查手段的发展（病原学检测）液芯HPVDNA分型检测固态芯片杂交法PCR方法抗原抗体反应透景液芯HPVDNA分型检测HPVDNA分型检测PCR检测免疫学方法病原学检测：

抗原抗体反应方法病原学检测：

抗原抗体反应方法v原理：

抗原抗体反应v平台：

金标卡法、金标渗滤法简单快速。

但简单快速。

但非特异方法，不能定量、不能分型，临床意义不明显。

非特异方法，不能定量、不能分型，临床意义不明显。

HPV检测方法检测方法HPV检测方法检测方法透景液芯透景液芯HPV分型检测分型检测港龙匹基亚能HC-II凯普达安病毒学检测：

人乳头瘤病毒（病毒学检测：

人乳头瘤病毒（HPV）基因检测）基因检测v病毒学检测：

人乳头病毒学检测：

人乳头瘤病毒（瘤病毒（HPV）基因检）基因检测测目前资料证明，HPV感染是宫颈癌及其癌前病变的最主要病因，99.8的宫颈癌患者中可以发现HPV病毒，如果HPV检测为阴性，则在近3年内几乎没有患宫颈癌的风险。

方法：

用特制小毛刷在宫颈处采集细胞，患者无损伤和痛苦。

该方法的准确率相当高，而且可以有效延长筛查间隔。

PCR原理原理PCRPCR：

聚合酶链式反应聚合酶链式反应引物引物aa22nn指数扩增指数扩增模板模板引物引物但受原料、反映中产生抑制因素的影响，整个反映会达但受原料、反映中产生抑制因素的影响，整个反映会达到平台期。

到平台期。

PCRPCR产物的产量在产物的产量在1010的的1212次方左右。

次方左右。

在在PCRPCR反应体系中有上下游反应体系中有上下游引物，引物，在荧光在荧光PCRPCR反应体系中反应体系中有上下游引物，有上下游引物，加入荧光基团加入荧光基团探针，探针，发光发光猝灭猝灭有因为很多物质都能发光，有因为很多物质都能发光，所以在荧光所以在荧光PCRPCR反应体系反应体系中有中有本底荧光本底荧光本底荧光本底荧光FAMMGBTaqMan探针探针ReporterdyeQuencherdyeTaq酶的外切活性酶的外切活性荧光定量荧光定量PCR技术：

技术：

每一个循环的产物进行定量分析每一个循环的产物进行定量分析所谓所谓real-timeQ-PCRreal-timeQ-PCR技术，是指在技术，是指在PCRPCR反应体反应体系中加入荧光基团，利用系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整荧光信号累积实时监测整个个PCRPCR进程。

进程。

阈值与阈值与C（t）值值阈值线阈值线阈值线阈值线（XXnn）：

尽可能低，尽可能和曲线的交点在指数扩增期，尽可能低，尽可能和曲线的交点在指数扩增期，尽可能低，尽可能和曲线的交点在指数扩增期，尽可能低，尽可能和曲线的交点在指数扩增期，但有要在本底以上。

但有要在本底以上。

但有要在本底以上。

但有要在本底以上。

C（t）C（t）值值值值（nn）：

荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数循环次数循环次数循环次数18.12+/-0.04阈值线阈值线18.12+/-0.0418.12+/-0.04C（t）值值18.12+/-0.04C（t）值值实验过程中荧光信号的变化实验过程中荧光信号的变化优缺点比较优缺点比较实时荧光定量PCR常规PCR荧光实时分析每一次循环产物凝胶电泳分析终产物产物不开盖，不会造成污染在医院易于推广产物需要从管中取出，电泳，很容易造成污染在医院很难推广计算机自动纪录分析检测方法费时费力探针的灵敏度比EB高10100倍EB（一种染料）灵敏度低，且有毒实时荧光定量法实时荧光定量法样本DNA提取试剂准备与加样程序设置与扩增结果分析与报告HPV分型检测的必要性分型检测的必要性1、HPV的感染在治疗前后，有可能的感染在治疗前后，有可能存在型别的差异，这可以作为医生存在型别的差异，这可以作为医生治疗效果的评估指标。

治疗效果的评估指标。

2、连续两次、连续两次HPV分型检测显示单一型分型检测显示单一型别的高危亚型的感染，显示宫颈癌发别的高危亚型的感染，显示宫颈癌发生的可能性增大，应引起极大重视。

生的可能性增大，应引起极大重视。

分型检测分型检测分型检测分型检测HPVHPV3、HPV的感染在不同的地区，占主要地的感染在不同的地区，占主要地位的型别有所不同，分型检测有利对于各地位的型别有所不同，分型检测有利对于各地研究、使用疫苗进行研究、使用疫苗进行HPV感染的预防控制感染的预防控制。

凯普导流杂交法凯普导流杂交法凯普导流杂交法凯普导流杂交法原理：

原理：

采用DNA反向点杂交技术和导流杂交技术，用特定的DNA探针对样本进行基因分型检测。

凯普导流杂交法凯普导流杂交法单重感染单重感染单重感染单重感染HPV16HPV16多重感染多重感染多重感染多重感染HPV16HPV16，3333，5353，6666注注注注：

质粒为模板：

质粒为模板：

质粒为模板：

质粒为模板亚能膜杂交法原理亚能膜杂交法原理亚能膜杂交法亚能膜杂交法HPVDNA的检测的检测杂交捕获法杂交捕获法n方法：

采用分子杂交分子杂交+酶标板技术酶标板技术+化学发光化学发光信号放大信号放大n平台：

第二代杂交捕获仪（HC-II）。

n灵敏度为灵敏度为95%左右，特异度为左右，特异度为85%左右左右Luminex100TM多功能流式点阵仪液态芯片是基于Luminex100TM（美国Luminex公司）的是一个多功能生物芯片平台，是唯一既能检测蛋白、又能检测核酸的高通量技术平台。

通常用于免疫分析、核酸分析、酶学分析、受体和配体分析等临床检测和科学研究。

LuminexTM有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号和计算机运用法则，造就了无与伦比的检测特异性和灵敏度。

Luminex100TMLuminex100TMLuminex100TMDNAProteinLuminex100TMLuminex100TM免疫分析生物安全核酸研究酶学分析药物研发受体和配体识别Luminex100TM流式点阵仪HPV分型检测原理分型检测原理1234567891012345678910共价交联技术共价交联技术共价交联技术共价交联技术CONH液态芯片核心技术及其原理4263318525816液态芯片核心技术及其原理1618611液态芯片核心技术及其原理液芯液芯HPVDNA检测原理检测原理液芯液芯HPVDNA分型法检测原理分型法检测原理v低危亚型低危亚型6、11、40、42、44、53、54v高危亚型高危亚型16、18、31、33、35、39、45、52、58、26、51、55、56、59、61、66、68、73、83