厌氧氨氧化菌的特性与分类图文精Word格式.docx
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胞质内膜;
ri:
核糖细胞质;
am:
厌氧氨氧化体膜;
a:
厌氧氨氧化体.长箭头:
管状结构;
短箭头:
电子密集颗粒.
图1 厌氧氨氧化菌细胞的超微结构图
Fig.1 Ultrastructureofanammoxbacterialcell
厌氧氨氧化菌形态多样,呈球形、卵形等,直径0畅8~1畅1μm[6
].厌氧氨氧化菌是革兰氏阴性菌.细胞外无荚膜.细胞壁表面有火山口状结构[
7]
少数有菌毛[
6]
.细胞内分隔成3部分:
厌氧氨氧化体(anammoxosome、核糖细胞质(ri
boplasm及外室细胞质(paryphoplasm.核糖细胞质中含有核糖体和拟核,大部分DNA存在于此[
8]
.该菌出芽生殖.
厌氧氨氧化体是厌氧氨氧化菌所特有的结构,占细胞体积的50%~80%,厌氧氨氧化反应在其内进行[
.厌氧氨氧化体由双层膜包围,
该膜深深陷入厌氧氨氧化体内部[9
](图1.厌氧氨氧化体不含核糖体,但含六角形的管状结构和电子密集颗粒.透射电镜及能谱仪分析表
明,这些电子密集颗粒中含有铁元素[9
].
1畅2 细胞壁和细胞膜化学组分特征
厌氧氨氧化菌的细胞壁主要由蛋白质组成,不含肽聚糖.细胞膜中含有特殊的阶梯烷膜脂,
由多个环丁烷组合而成,形状类似阶梯[10
].在各种厌氧氨氧化菌中,阶梯烷膜脂的含量基本相似.疏水的阶梯烷膜脂与亲水的胆碱磷酸、乙醇胺磷酸或甘油磷酸结合形成磷脂,构成细胞膜的骨架.细胞膜中的非阶梯烷膜脂由直链脂肪酸、支链脂肪酸、单饱和脂肪酸和三萜系化合物组成.三萜系化合物包括C27的藿烷类化合物
(hopanoi
d,细菌藿四醇(bacteriohopanetetrol,BHT和鲨烯(squalene,C30H50.其中,BHT首次发现于严格厌氧菌中[11
].在不同厌氧氨氧化菌种中,非阶梯烷膜脂的种类和含量变化较大[12
].曾一度认为阶梯烷膜脂只存在于厌氧氨氧化体的双层膜上,其功能是限制有毒中间产物的扩散.目前认为阶梯烷膜脂存在于厌氧氨氧化菌的所有膜结构上(包括细胞质膜,它们与非阶梯烷膜脂相结合,以确保其他膜结构的穿透性好
于厌氧氨氧化体膜[10,12]
.1畅3 富集培养与分离特征
厌氧氨氧化菌的富集培养选用自然样品作为接种物(如活性污泥、海洋底泥、土壤,按目标菌群所需的最佳生境条件,以含有适量基质和营养元素的培养液(表1在生物反应器中进行[7
].厌氧氨氧化菌生长缓慢,倍增时间10~
30d[8
].富集培养物呈红色,性状粘稠,含有较
多的胞外多聚物[13]
.
厌氧氨氧化菌是一种难培养的微生物,采用系列稀释分离、平板划线分离、显微单细胞分离等传统微生物分离方法,均未分离成功.迄今为止,密度梯度离心法是成功分离厌氧氨氧化菌的唯一方法.其原理是通过离心使不同密度
的细菌细胞形成不同的沉降带[14
].具体操作方法如下:
首先,用超声波温和破碎厌氧氨氧化菌富集培养物,将菌群分散成单个细胞;
接着,离心去除残留的聚集体(生物膜或絮体碎片;
最后,将分散的细胞用Percoll密度梯度离心,使厌氧氨氧化菌在离心管内形成一条深红色条带.采用该方法可获得高纯度的细胞悬液,每
200~800个细胞中可只含有1个污染细胞[15
表1 富集厌氧氨氧化菌的营养元素组成Table1 Nutrientsusedforanammoxbacteriaenrichment
营养物质量浓度/(g爛L-1KH2PO40畅027
CaCl20畅18
MgSO4爛7H2O0畅3
KHCO30畅5
微量元素溶液ⅠEDTA5
FeSO45
微量元素溶液ⅡEDTA15
H3BO40畅014
MnCl2爛4H2O0畅99
CuSO4爛5H2O0畅25
ZnSO4爛7H2O0畅43
NiCl2爛6H2O0畅19
NaMoO4爛2H2O0畅22
NaSeO4爛10H2O0畅21
1畅4 生理生化特征
厌氧氨氧化菌为化能自养型细菌[7],以二氧化碳作为唯一碳源,通过将亚硝酸氧化成硝酸来获得能量,并通过乙酰‐CoA途径同化二氧化碳[16].虽然有的厌氧氨氧化菌能够转化丙酸、乙酸等有机物质,但它们不能将其用作碳源[17‐18].厌氧氨氧化菌对氧敏感,只能在氧分压低于5%氧饱和(以空气中的氧浓度为100%的条件下生存,一旦氧分压超过18%氧饱和,其活性即受抑制,但该抑制是可逆的[19‐20].厌氧氨氧化菌的最佳生长pH范围为6畅7~8畅3,最佳生长温度范围为20~43℃[7].厌氧氨氧化菌对氨和亚硝酸的亲和力常数都低于1×
10-4gN爛L-1[19].基质浓度过高会抑制厌氧氨氧化菌活性[19,21](表2.
表2 基质对厌氧氨氧化菌的抑制浓度
Table2 Inhibitionconcentrationsofnitrogenoussubstratesonanammoxbacteriammol爛L-1
基 质抑制浓度半抑制浓度NH4+‐N7055
NO2-‐N725
注:
半抑制浓度代表抑制50%厌氧氨氧化活性的基质浓度.
1997年,vandeGraff等[22]基于15N示踪研究,提出了厌氧氨氧化菌代谢模型(图2;
基于厌氧氨氧化菌基因组学和酶学研究,其他研究者[23,6]对此代谢模型作了修正(图3.2种模型的最大区别在于:
前者认为亚硝酸的还原产物是羟氨(NH2OH,后者则认为亚硝酸的还原产物是NO.根据改进的模型,亚硝酸先被含有细胞色素c(CytC和细胞色素d1的亚硝酸还原酶(NiR还原成一氧化氮(NO2-+e-NO;
再由联氨水解酶(HH将一氧化氮与氨结合成联氨(NO+NH4++3e-N2H4;
最后由联氨氧化酶(HZO或羟氨氧化还原酶(HAO将联氨氧化成氮气(N2H4N2+4e-.在联氨氧化成氮气的过程中,可产生4个电子,这4个电子通过细胞色素c、泛醌、细胞色素bc1复合体以及其他细胞色素c传递给NiR和HH,其中3个电子传递给NiR,1个电子传递给HH.伴随电子传递,质子被排放至厌氧氨氧化体膜外侧,在该膜两侧形成质子梯度,驱动ATP合成[23‐28
图2 基于15N示踪研究的代谢途径
Fig.2 Metabolicpathwaybasedon15Nstudy
HAO和HZO是厌氧氨氧化菌中研究的较为深入的2种酶.HAO广泛存在于好氧氨氧化细菌、反硝化细菌等微生物中,它不但能够催化羟氨氧化成亚硝酸,也能够将亚硝酸还原为羟氨,还能催化氧化联氨[1].从厌氧氨氧化菌中分离获得的HAO不同于从好氧氨氧化细菌中获得的HAO,它不能将羟氨转化成亚硝酸,只能将其转化成NO或N2O.已被纯化的HAO有2种,虽然两者的分子量和亚单位不同,但是均含大量c型血红素[16个和(26±
4个]和P468细胞色素.该酶也能催化氧化联氨,
浙江大学学报(农业与生命科学版
但对羟氨的亲和力更强[24,26
]
(表3.HZO也已从厌氧氨氧化菌中分离纯化,它只能催化氧化联氨,不能催化氧化羟氨.但羟氨能与该酶结
合,从而对联氨产生竞争性抑制[25
图3 基于基因组学和酶学的代谢途径
Fig.3 Metabolicpathwaybasedongenomicsandenzymology
表3 厌氧氨氧化菌HAO和HZO酶的特性
Table3 CharacteristicsofHAOandHZOpurifiedfromanammoxbacteria
性 质Brocadiaanammoxidans
HAOKSU‐1菌株
HZOHAO分子质量/ku183±
12130±
10118±
10亚单位/ku586253组成形态α3α2α2血红素含量26±
41616细胞色素P468
P472P468氧化活性NH2OHμmax/(μm爛min-1
爛mg-1
21aND9畅6aKm,Ki/μm26a(Km2畅4b(Ki33a(Km周转次数/min-13畅9×
103
NDNRN2H
4
μmax/(μm爛min-1爛mg-1
1畅1a6畅2b0畅54akm/μm
18a5畅5b25a周转次数/min-1
2畅0×
102
1畅7×
NR
a以PBS和MTT为电子受体;
b
以细胞色素c为电子受体;
ND:
未检出;
NR:
未报道.
1畅5 生态学特征
目前发现的厌氧氨氧化菌有5个属,9个种[18
](图4.
待定厌氧氨氧化布罗卡地菌(CandidatusBrocadiaanammoxidans"
待定荧光布罗卡地菌(CandidatusBrocadiafulgida"
待定斯图加特库氏菌(CandidatusKueneniastuttgartiensis"
待定布罗达氏阶梯烷菌
(CandidatusScalinduabrodae"
待定韦格氏阶梯烷菌(CandidatusScalinduawagneri"
待定亚洲杰特氏菌(CandidatusJetteniaasiatica"
待定丙酸厌氧氨氧化球菌(CandidatusAnammoxoglobuspropionicus"
待定硫酸盐厌氧氨氧化球菌(CandidatusAnammoxoglobus
sulfate"
分离自污水处理厂构筑物或实验室反
应器内[17,29‐34]
;
待定黑海阶梯烷菌(CandidatusScalinduasorokinii"
分离自海水中[35
].检测表明,厌氧氨氧化菌也存在于海岸、浅滩、入河口的
底泥中.厌氧氨氧化菌的分布极其广泛[36‐38]
. 由于厌氧氨氧化同时需要氨和亚硝酸2种基质,在实验室反应器中或在污水厂构筑物中,当溶解氧浓度较低时,厌氧氨氧化菌可与好氧氨氧化菌共同存在,互惠互利.好氧氨氧化菌产生的亚硝酸用作厌氧氨氧化菌的基质,而厌氧氨氧化菌消耗亚硝酸,则可解除亚硝酸对好氧
6
74第35卷
郑平,张蕾,等:
厌氧氨氧化菌的特性与分类氨氧化菌的抑制[39
对厌氧氨氧化菌的生态学研究主要依赖分子生物学手段,其中包括聚合酶链式反应(PCR、
变性梯度凝胶电泳(DGGE、克隆测序和荧光原位杂交(FISH.在厌氧氨氧化菌生态
学研究中常用的PCR引物[17,37,40‐42]
列于表
4.
图4 厌氧氨氧化菌的系统发育树
Fig.4 Phylogenetictreeofanammoxbacteria
表4 研究厌氧氨氧化菌生态学常用的PCR引物
Table4 PCRprimersusuallyusedinecologicalresearchofanammoxbacteria
目标菌群
上游引物名称
上游引物序列
下游引物名称下游引物序列
Pla46F
5‐GACTTGCATGCCTAATCC‐3细菌通用引物630R
5‐CAKAAAGGAGGTGATCC‐3
浮霉状菌
Pla46F5‐GACTTGCATGCCTAATCC‐3细菌通用引物1406R5‐ACGGGCGGTGTGTRC‐3Pla46F5‐GACTTGCATGCCTAATCC‐3细菌通用引物1392R5‐ACGGGCGGTGTGTAC‐3厌氧氨氧化菌
Amx368F5‐CCTTTCGGGCATTGCGAA‐3细菌通用引物1392R5‐ACGGGCGGTGTGTAC‐3
Amx368F
5‐CCTTTCGGGCATTGCGAA‐3Amx820R5‐AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC‐3Amx809F5‐GCCGTAAACGATGGGCACT‐3
Amx1066R
5‐AACGTCTCACGACACGAGCTG‐3Amx818F
5‐ATGGGCACTMRGTAGAGGGGTTT‐3Amx1066R
5‐AACGTCTCACGACACGAGCTG‐3
2 厌氧氨氧化菌的分类
浮霉状菌目(Planctomycetales是细菌域中分化较早的一个分支.该目包括2个科,9个属,分别为Planctomyces,Pirellula,Gemmata,Isosphaera,CandidatusBrocadia,CandidatusKuenenia,CandidatusScalindua,CandidatusJettenia,CandidatusAnammoxoglobus.其中,前4个属归入浮霉状菌科(Planctomycetaceae,皆为化能异养型好氧菌,后5个属归入厌氧氨氧化菌科(Anammoxaceae,皆为化能自养型厌氧菌,并具有厌氧氨氧化功能
[43‐44]
2畅1 CandidatusBrocadiaanammoxidans 该种发现于荷兰Gist‐Brocades污水处理
厂,名字中的Brocadia"
、
anammoxidans"
分别图5 CandidatusBrocadiaanammoxidans菌落的电
子显微镜照片
Fig.5 MicroscopicgraphofCandidatusBrocadia
anammoxidanscolonies
指发现地和代谢方式[
45]
.它是第一个被富集鉴
定的厌氧氨氧化菌种,也是Candidatus
7
74 第5期
478浙江大学学报(农业与生命科学版)第35卷 Brocadia"属的代表种.菌体呈球形,具有前述厌氧氨氧化菌的细胞结构特征,如细胞表面有火山口状结构,内含厌氧氨氧化体,无荚膜,无[7]鞭毛和菌毛(图5).细胞膜含阶梯烷膜脂,约[10]占细胞总脂类的34%.以亚硝酸为能源,以二氧化碳为碳源,不能利用小分子有机酸类,如甲酸、丙酸等.倍增时间11d,最佳生长pH8,[7,46]最佳生长温度40℃.已从该菌体内分离获得分子量为(183±
12)ku的HAO,并证明它能同时氧化羟氨和联氨[24].它在GenBank中的注册号为AF375994.2畅2 CandidatusBrocadifuldaagi 该种发现于荷兰鹿特丹污水处理厂,名字中的fulda"来源于英语中fuld"一词,gigi意为灿烂的,闪耀的",因这种细菌形成的胞外多聚,18物能够发光而命名[30].胞呈球形,直径细0畅7~1μm.该菌为化能自养型厌氧菌,以亚硝酸为能源,以二氧化碳为碳源,同时能以亚硝酸或硝酸为电子受体氧化甲酸、丙酸、单甲胺和二甲胺,但这些有机物并不用于细胞物质的合成[18].菌体具有前述厌氧氨氧化菌的细胞结构特征.在细胞膜中,阶梯烷膜脂占细胞总脂类[11]63%.16SrRNA序列分析表明,该菌与CandidatusBrocadianamoxiadans"的相似性[18]最高,94%达.它在GenBank中的注册号为DQ459989.2畅3 CandidatusKuenenistuttagartisensi 该种发现于生物滤池中,名字中Kuenenia"是在厌氧氨氧化领域作出杰出贡献的荷兰微生物学家JGisKuenen的姓氏,畅jstuttgartis"是该菌的发现地[31].ensi该菌呈球状,直径1μm左右(图6).化能自养型,不能利用甲酸、丙酸等有机酸.菌体具有前述厌氧氨氧化菌的细胞结构特征.在细胞中,阶梯烷膜脂占[11]细胞总脂类的45%.已从该菌体内分离获得HAO和HZO,前者能同时氧化羟氨和联氨,后者只能氧化联氨.该菌在GenBank中的注册号为AF375995.2畅4 CandiusScalnduabrodae和CandiusdatidatScalnduawagnerii 两菌都发现于英国Pitsea垃圾填埋场的污水处理厂,它们名字中的Scalndua"表示细i菌细胞中具有阶梯烷,brodae"和wagneri"是为了纪念厌氧氨氧化反应的第一个预言者———奥地利理论化学家EngelbertBroda以及为厌氧氨氧化菌生态学和系统发育学研究作出贡献[32]的德国微生物学家MichaelWagner而命名.两菌均为化能自养型的兼性厌氧菌.菌体呈球形,直径大约1μm(图7).它们能以亚硝酸为电子受体氧化氨,以二氧化碳为唯一碳源;
能将羟氨转化成联氨.菌体具有前述厌氧氨氧化菌的细胞结构特征,细胞膜含有阶梯烷膜脂,细胞内拥有厌氧氨氧化体.Scalnduabrodae菌在i落中,细胞排列松散;
而在Scalnduawagnerii菌落中,细胞排列紧密.两菌之间16SrRNA序[32]列的相似度为93%.它们在GenBank中的注册号分别为AY254883和AY254882.图7 Candiusdat图6 CandidatusKuenenistgartis菌落的电auttensi子显微镜照片Fi.6 MigcroscopigraphofCandidatusKuenenicastuttgartiensiscoloniesScalnduaibrodae(A)和CandiusScalnduawagneri(B)菌落的电子dati显微镜照片Fi. Mig7croscopigraphofCandidatusScalnduabrodaeciinduawagneri(B)(A)andCandidatusScalcolonies
第5期郑平,张蕾,:
厌氧氨氧化菌的特性与分类等47