临床微生物学检验技术33章 粪便细菌学检验.pptx

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第三十三章粪便标本的细菌学检验夏云前言腹泻一般分为以下几类：

1.吸收不良性腹泻2.分泌性腹泻（产肠毒素性腹泻）3.侵袭性腹泻外广谱抗菌药物、放疗、化疗药物及激素类药物的长期不规范应用以及各种侵入性操作也可以引起继发性肠道感染。

粪便的细菌学检验是诊断感染性腹泻的重要手段第一节标本采集、运送和验收第二节细菌学检验第三节报告与解释目录第一节标本采集、运送和验收采集指征标本的采集标本的运送标本的验收重点提示一、采集指征排便次数3次/日，粪便性状异常（稀便、水样便、粘液脓血便）排便时有腹痛、下坠、里急后重、肛门灼痛等症状发热、恶心、呕吐、食欲明显降低及全身不适等症状二、标本的采集1.尽可能在发病急性期和抗生素治疗前进行，以提高致病菌的检出率2.每天采集1份标本，连续3天，共采集3份标本采集方法1.自然排便采集挑取有粘液、脓血部位的粪便或液体粪便取絮状物23ml，放置于无菌容器内，及时送检2.直肠肛拭采集适用于排便困难患者或婴幼儿，置于卡-布（Cary-Blair）运送培养基或磷酸盐甘油缓冲液（pH70）中送检二、标本的采集三、标本的运送1.标本采集后应尽快送检室温保存2小时2.特殊细菌艰难梭菌培养标本在4环境24小时；弯曲菌与弧菌的标本需加入CaCl2（100mg/L）3.置于运送培养基中的直肠拭子保存时间室温24小时四、标本的验收检查申请单信息填写是否完整、正确，包括标本采集时间、采集方式、抗生素使用情况、标本量是否足够、标本容器有无渗漏等拒收标准1.粪便标本放置时间超过2小时2.成形粪便或粪便标本混有尿液3.粪便标本量过少、干涸或保存不当4.直肠拭子未置于运送培养基中应及时与临床医师联系，说明原因，要求重新留取标本送检第二节细菌学检验检验程序检验方法显微镜检查培养和鉴定重点提示粪便或肛拭标本需氧培养根据临床特殊要求SS、XLD、麦康凯、血平板35培养1824小时生化反应初步鉴定血清学鉴定分离弯曲菌分离艰难梭菌分离弧菌分离致病大肠埃希菌O157观察菌落特征、涂片染色观察菌落特征、涂片染色血清学鉴定观察菌落特征、涂片染色Camp-BAP血琼脂35微CCFA平板和厌氧血琼脂TCBS平板山梨醇麦康凯平板需氧培养48平板37厌小时氧培养48小时最终报告细菌鉴定药敏试验图33-1一、检验程序二、检验方法

（一）显微镜检查粪便标本含有大量的正常菌群，大部分情况下仅依靠染色性和形态很难分辨是否为病原菌，因此一般情况下粪便标本无需做涂片检查。

仅在怀疑为霍乱弧菌、艰难梭菌、结核分枝杆菌感染以及菌群失调引起的腹泻时才进行显微镜检查不染色标本1.霍乱弧菌感染标本呈米泔样或洗肉水样，镜检发现逗点状或弯曲状的弧菌，呈流星样穿梭，运动活泼。

加入O1群或O139群霍乱弧菌多价诊断血清，大于80%的细菌停止运动或运动明显减弱2.弯曲菌感染呈S形、螺旋形并快速、拧塞样或投镖样运动的细菌3.酵母样真菌感染高倍镜发现光亮的卵圆形孢子或假菌丝染色检查1.霍乱弧菌鱼群状排列的杆状或弧形革兰阴性杆菌2.空肠弯曲菌细小、长而弯曲，呈S形或螺旋形、海鸥状的革兰阴性弧菌3.艰难梭菌革兰阳性粗大杆菌、无荚膜、卵圆形芽胞位于菌体一端同时伴有炎症细胞4.酵母样真菌瓜子状革兰阳性孢子或假菌丝5.结核分枝杆菌抗酸染色发现红色抗酸杆菌二、检验方法

（二）培养与鉴定医院中引起的腹泻一般不会是感染了食源性病原菌引起，故对于住院超过3天的患者的粪便标本不进行常规培养，除非是为了分离艰难梭菌和测定毒素以诊断抗生素相关性腹泻。

（二）培养与鉴定1沙门、志贺菌属菌培养黏液、脓血便接种于SS琼脂平板或XLD琼脂平板和麦康凯（MAC）琼脂平板（或中国蓝琼脂平板）以及血平板，35孵育1824小时，挑取不发酵乳糖菌落，至三糖铁琼脂初步观察生化反应并进行血清学凝集试验。

可根据生化反应结果初步判断细菌菌属，再根据血清学鉴定结果鉴定至种

（二）培养与鉴定2.肠病原性大肠埃希菌引起腹泻的大肠埃希菌一般有5种类型，即产毒素大肠埃希菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）以及肠聚集性大肠埃希菌（EAggEC）。

粪便标本接种于MAC或中国蓝琼脂平板、显色培养基及SMAC平板，35C培养1824小时，挑取乳糖发酵（EIEC不发酵或迟缓发酵）菌落穿刺接种三糖铁琼脂和尿素动力靛基质培养基进行初步生化鉴定，并进行血清学分型。

一般为检测EHEC，大便标本可增加接种于山梨醇-麦康凯琼脂平板（含1%山梨糖醇代替乳糖），EHEC不发酵山梨醇呈无色，而其他大肠埃希菌能发酵呈红色，借此可快速分离处EHEC。

（二）培养与鉴定3.空肠弯曲菌取明显病变部位的粪便接种于弯曲菌选择培养基（Camp-BAP血琼脂），或采取CEM空肠弯曲菌增菌培养基43C微需氧气环境培养1848小时后再转种Camp-BAP血琼脂。

培养物置43C微需氧环境培养2448小时后观察菌落特征（非溶血、扁平、灰色、粘稠状菌落，或沿着接种区扩散的菌落），挑取可以菌落进行鉴定

（二）培养与鉴定4.霍乱弧菌对于米泔样或洗肉水样大便的疑似标本可直接接种于庆大霉素亚碲酸钾碱性琼脂平板或TCBS平板，同时采用碱性蛋白胨水作增菌培养再转种庆大霉素亚碲酸钾碱性琼脂平板或TCBS平板，置35C培养1824小时，挑取可疑菌落进行血清学试验和生化鉴定，必要时可做2次增菌后分离鉴定。

如果出现与O1群或O139霍乱弧菌诊断血清的阳性凝集反应，提示为霍乱弧菌感染，应立刻按疫情上报程序进行上报，同时进行涂片检查形态及悬滴法观察动力，并进行制动试验以进一步明确诊断。

有鱼霍乱弧菌为高致病性微生物，应加强个人防护，及时对标本和环境进行消毒处理。

（二）培养与鉴定5.小肠结肠炎耶尔森菌将标本接种小肠结肠炎耶尔森菌培养基平板（CIN）及麦康凯琼脂平板（或中国蓝琼脂平板），分别置于2225C及35C培养48小时，前者用于分离小肠结肠炎耶尔森菌，后者用于分离沙门、志贺菌属菌。

挑取可疑菌落接种克氏双糖铁和尿素动力靛基质培养基进行初步生化鉴定，最后采用商品化鉴定系统鉴定至种。

为提高阳性检出率，可使用pH7.4的0.15mol/LPBS增菌液做冷增菌处理（将增菌管放4C下21日，每周转种1次），或以0.5%KOH（1：

2）处理2分钟，再接种麦康凯平板。

（二）培养与鉴定6.副溶血弧菌将粪便标本接种于弧菌增菌液中，68小时接种TCBS平板，同时接种TCBS平板，35C培养1824小时，检查有无呈绿色或蓝色中心，圆形，直径23mm的菌落，挑取可疑菌落接种克氏双糖铁和尿素动力靛基质培养基进行初步生化鉴定，最后采用商品化鉴定系统鉴定至种。

（二）培养与鉴定7.艰难梭菌将新鲜可疑标本（黄绿色或海蓝色稀水便）立即接种环丝氨酸-甲氧头孢菌素-果糖琼脂（CCFA）平板和厌氧血琼脂平板上，37C厌氧培养48小时，CCFA上观察是否有黄色粗玻璃状外观菌落形成，挑取可疑菌落进行纯培养并进行鉴定。

（二）培养与鉴定8.真菌培养粪便接种于含氯霉素的沙保弱琼脂平板或显色培养基，置2535C和35C培养2448小时，取可疑菌落进行涂片和鉴定。

9.结核分枝杆菌培养取12g成形便或5ml稀便进行去污染处理，离心后将沉淀接种于罗氏培养基，置35C培养68周，挑取可疑菌落进行鉴定。

第三节报告与解释一、阳性结果报告1显微镜检查对部分具有典型形态的细菌可报告“发现革兰X（阴/阳）性X（球/杆）菌，疑为XX菌”，如“发现革兰阴性杆菌，呈弧形，鱼群样排列，疑似霍乱弧菌”，发现红色抗酸杆菌可报告“找到抗酸杆菌”等一、阳性结果报告1.显微镜检查一般粪便的显微镜检查对临川诊断意义不大，但部分具有典型形态的细菌具有提示作用，可报告“发现革兰X（阴/阳）性X（球/杆）菌，疑为XX菌”，如“发现革兰阴性杆菌，呈弧形，鱼群样排列，疑似霍乱弧菌”，发现红色抗酸杆菌可报告“找到抗酸杆菌”2.培养结果报告方式应以分离的菌种的结果而定，如分离到沙门菌或志贺菌，霍乱弧菌等，并报告其血清学分型和药敏结果。

其他细菌报告分离到XX菌，如做药敏试验应报告药敏试验结果。

培养出霍乱弧菌，伤寒沙门菌、致病性大肠埃希菌O157等应按传染病流程报告，并送当地疾病预防控制中心复核。

二、阴性结果报告对于没有典型形态的细菌涂片，可报告1显微镜检查“涂片未找到XX菌”2培养结果培养阴性结果不应采用“未检出致病菌”或“无致病菌发现”等的报告方式，而应采用如“未检出沙门菌、志贺菌”和与此类似的其他菌检测的报告方式本章小结粪便的细菌学检查主要用于食源性病原菌引起的腹泻和医院感染中抗生素相关性腹泻的诊断分离培养基主要包括强选择培养基SS琼脂平板或XLD琼脂平板和弱选择培养基麦康凯（MAC）琼脂平板（或中国蓝琼脂平板）以及血平板，细菌鉴定主要依靠生化反应和血清学试验涂片仅对于部分具有典型形态的细菌具有快速诊断价值Thankyou