免疫组化总结Word下载.docx

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⑤免疫学方法：

利用免疫学原理与其技术研究细胞的化学成分。

如免疫组织化学、免疫电镜等。

⑥分子生物学法：

原位杂交组织化学技术等。

2、组织化学技术的基本要求:

1．保持良好的组织和细胞形态结构，保持组织和细胞生前的化学成分和酶的活性，防止组织自溶，使反应的产物不易位、不弥散，保证反应产物定位精确。

2．反应产物具有可视性，即反应产物必须呈现颜色，而且必须是有色沉淀，颗粒微细，不被溶解，定位于原位。

反应产物具有定量的可能性，即反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系3．所用组织化学方法必须具备一定的特异性，即仅与某种化学成分发生反应，以便获取正确的实验结果。

倘若组织化学试剂同时能与二种以上物质反应，则必须有进一步的分析方法。

此外还要具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。

4．所用方法稳定并能重复，以利于重复观察和验证。

5．设置必要的对照实验，否则难以判断其结果的可靠性。

第2章组织化学与免疫组织化学染色样品制备

第一节取材

一、组织标本取材:

准确、快速。

达到保持生活状态下组织细胞形态结构的完整性、尽量保持其化学成分和酶的活性，更要保持组织细胞的抗原性不受损。

动物取材时应先将动物麻醉再处死，其方法如下：

1.乙醚吸入麻醉法2．戊巴比妥钠和乌拉坦麻醉法3．空气栓塞法

细胞标本的取材:

（一）培养细胞1．贴壁生长的细胞2．悬浮生长的细胞制备细胞悬液，加入离心涂片机内，1000r/min离心2min，细胞即可均匀分布于已涂黏附剂的载玻片上。

3.印片法主要应用于活组织标本检查和剖检标本取材。

新鲜标本做一剖面，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落的细胞便粘附在玻片上。

随后立即将载玻片浸入细胞固定液内5~10min，取出后自然干燥，低温保存备用。

其优点是简便省时，细胞抗原保存较好；

缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞有重叠，影响观察效果。

（二）涂片法

临床穿刺获取含有细胞的液体（腹水，胸水和心包液）或气管等分泌物可直接涂片，如果液体太多，可离心。

制成细胞悬液。

第2节固定（fixation）的目的是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败。

固定还能增加组织块硬度，使其更容易切片，使不同的结构更容易染色。

一、组织和细胞的固定方法

固定方法有物理固定和化学固定两类，物理固定可采用空气干燥（血涂片）、骤冷（在液氮中迅速冷冻）或微波固定等；

化学固定有浸润法（immersionmethod）和灌流法（perfusionmethod）。

（一）浸润法:

浸润法是组织化学和免疫组织化学常用的固定方法，一次要处理许多组织样品时也多用此法。

预先需估计固定剂的用量，并在取材前配好固定液。

固定液的用量应是样品的40倍，以保证组织充分固定。

固定时间可根据所选固定液和组织类型而定。

若进行酶组织化学染色，应在4℃短时间固定，固定时间长会导致酶活性减弱，甚至消失。

（二）灌流固定法:

此法是经血管途径，将固定液灌注到欲固定的器官内，使生活的细胞在原位及时迅速固定，取下组织之后再浸入相同的固定液内继续固定。

灌流固定时大动物多采用输液方式，小动物多采用心脏主动脉灌流，如大、小鼠。

在灌注固定液前，先用含抗凝剂的37℃生理盐水灌流，冲洗血管内的血液，防止血液凝固阻塞血管。

肝脏由鲜红颜色变为浅白色时，即可灌流固定液，灌注速度为5-10ml/min，应在30min内结束灌注并取材，而后将组织浸入相同的固定液中1～3小时。

灌流固定对组织结构和酶活性保存较好。

2、常用固定剂和固定方法

（一）组织常用固定剂和固定方法

1．甲醛是常用的醛类固定剂.其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。

（1）10%中性缓冲福尔马林

（2）4%多聚甲醛磷酸缓冲液

2.丙酮3.醇类

4.混合固定试剂

（1）Bouin’s液：

组织通常在4℃下固定68h。

此固定剂对肾脏结构保存不利。

（2）Zamboni液：

该固定液可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。

固定时间以618h为宜。

（3）AAF液（95%-100%乙醇85mL，冰醋酸5ML，浓甲醛10ML）：

较常用的固定液。

（4）Clarke改良固定剂（100%乙醇75mL，冰醋酸25mL），常用于冰冻切片的后固定。

（二）培养细胞常用固定剂和固定方法

在固定之前需用37℃预热的PBS轻洗细胞。

1.4%多聚甲醛磷酸缓冲液：

固定1020min,干燥。

2.甲醇：

-10℃甲醇固定520min,自然干燥。

3.丙酮：

4℃冷丙酮固定组织穿透性和脱水性强，抗原保存好，很少用于组织切片，常用于培养细胞和细胞涂片的固定，平时丙酮4℃低温保存备用，临用时，将载玻片插入冷丙酮内5~10min，取出后自然干燥。

4.乙醇：

95%乙醇脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而固定时间不宜过长（2h内）。

乙醇使蛋白变性程度轻，固定后蛋白可再溶解，在染色中孵育时间长的情况下，抗原可流失，并减弱反应强度。

5.乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合对组织穿透性极强，即使涂片上含较多的黏液，固定效果仍较好，是理想的细胞固定液。

第三节、包埋和切片

一、石蜡包埋

（一）包埋前脱水脱水（dehydration）是用梯度乙醇将固定好的组织内的水分脱去。

脱水的时间长短与组织块的大小，结构有关。

—般过程：

70％、80％乙醇可以长期的保存组织，90％乙醇4h，95％4h，100％乙醇（Ⅰ）2h，100％乙醇（Ⅱ）2h。

（2）透明常用的透明剂是二甲苯。

透明的时间长短与组织的大小、结构有关。

一般过程是:

二甲苯Ⅰ0.5～1h，二甲苯Ⅱ0.5～1h。

应注意脱水和透明的时间一定要充分，否则，不利于浸蜡，易使石蜡与组织之间形成夹层而使切片困难。

但时间也不能过长，否则组织变得过硬，不便于浸蜡，且易引起切片时脆裂。

（3）浸蜡:

经透明的组织入溶融的石蜡中浸透，一般需经三次，每次0.5~1h，其时间的长短与组织大小和结构有关，可以灵活掌握。

浸蜡时间不能过长或不足，其结果与脱水、透明不充分或过长结果相似。

用于HE染色的标本浸蜡和包埋的温度可限于65℃，而用于免疫组织化学的标本浸蜡和包埋温度不能高于60℃，否则，高温在非缓冲体系下会破坏组织中抗原。

因此，最好选择低熔点软蜡（56~58℃）。

（4）包埋:

浸透石蜡的组织块要入新的石蜡中冷却凝固，即包埋（embeding）。

包埋时，包埋器中倒入熔化的新蜡，在其凝固之前迅速放入组织块,放入前要分清组织的各个面，将所需断面朝下。

包埋有腔组织时，需平放或立放，以获得所需断面。

（5）修块:

石蜡凝固后，组织便包封在石蜡内。

切片前需把包有组织的蜡块修成一定形状，并且把各个面修平，注意不能把蜡边与组织边靠得太近亦不能太远，近则不易连片，远则废刀。

在修块时选适当的地方做标记，便于日后辨认。

二，切片:

良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。

（六）HE染色

（1）脱蜡主要用二甲苯脱蜡。

过程如下：

二甲苯（Ⅰ）15min二甲苯（Ⅱ）15min。

（2）梯度乙醇复水过程：

100％乙醇（Ⅰ）10min——100％乙醇（Ⅱ）10min——95％乙醇5min——90％乙醇5min——80％乙醇5min——70％乙醇5min

（3）水洗把组织片放入自来水中浸泡5min使组织充分水化，并可洗去多余的乙醇。

（4）苏木精染色由于苏木精是水溶性的，故要先入水。

水化后的组织片直接放入苏木精中浸10---20min，染细胞核。

（5）水洗:

组织片直接放入自来水中，一则可以洗去多余的苏木精染液，二则可以水化组织，加强苏木精的着色程度（因为苏木精是碱性染料，而白来水也是弱碱性的）。

（6）伊红染色:

再次水化的组织片直接入伊红染液中，染细胞质l0min左右。

（7）水洗:

再次入自来水中洗去多余的染液，这时的水化时间要短，因为伊红在水中易脱色。

（8）梯度乙醇脱水:

70％乙醇片刻十80％乙醇片刻90％乙醇5min——95％乙醇10min——100％乙醇（Ⅰ）l0min——100％乙醇（Ⅱ）l0min

（9）透明:

二甲苯（Ⅰ）10min，二甲苯（Ⅱ）lOmino透明时，时间一定要充足，确保乙醇完全被置换出来，这样可以使组织片透明、清晰。

【实验结果】:

细胞核染成紫蓝色，细胞质以及细胞外的胶原纤维等成分染成淡粉红色或淡红色，红蓝对比鲜明。

若苏木精染色过深，而脱色不足，则细胞质和胶原纤维等成分带有蓝色。

若苏木精染色过淡，则细胞核带有红色，对比不鲜明。

（七）封片:

透明后的组织片，自二甲苯中取出后，用绸布擦去多余的二甲苯，直接滴加中性树胶，然后压上盖玻片即可镜检。

注意：

1）滴加树胶要快，以免组织干燥影响观察效果2）树胶不用太多，盖住组织即可3）盖玻片时，要用镊子夹住盖玻片，让盖玻片的—端先接触树胶，再轻轻盖好，以防止出现气泡

（二）冰冻切片:

（frozensection）是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法,最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。

新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。

组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。

一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小，冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大，含水量较多的组织中较易发生。

1.防止组织中冰晶形成的方法

（1）速冻使组织温度骤降，减少冰晶的形成。

方法包括：

1）干冰-丙酮（酒精）法2）液氮法

（2）应用蔗糖溶液

2.恒冷箱切片法

1，取材:

根据研究目的取所需组织（如切取小鼠肝脏1.0X1.0X0.5cm大小的组织块），用滤纸吸去多余的水分，将组织块平放于用锡纸特制小盒（直径约2cm）或软塑瓶盖内。

加适量OCT包埋剂浸没组织，4℃20～30min。

2，组织冷冻:

将150～200ml丙酮装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和，不再冒泡时，温度可达-70℃，之后将含有组织块的小盒轻轻放到干冰制冷后的丙酮液面上。

（注意不要使丙酮进入包埋液中），待数十秒后组织冻结即可置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。

3，切片:

切片前1小时将恒冷箱切片机的温度设定为-18℃左右，以备切片。

切片时温度以-15～-18℃为宦，温度过低组织易破碎。

切片厚度以4～6um为宜。

组织切片可直接贴附于载玻片，或贴附于涂有明胶或防脱片剂内载玻片上以减少组织片脱落。

切片于室温干燥或风吹30min分钟以上干燥，即可直接进入染色或冻存。

4，冰冻切片的保存:

冰冻切片后如不染色，可吹干后装入密封的标本盒内，外包塑料袋，贮存于低温冰箱，或进行短暂预固定后于低温冰箱保存。

染色前，从冰箱内取出切片，置室温干燥10min，再经丙酮固定5～10min（未固定者），即可进入染色程序。

（三）振动切片:

用振动切片机（vibratome）可以把新鲜组织（不固定、不冷冻）切成厚片20～400μm，以漂浮法在反应板内进行组织化学或免疫组织化学染色。

因组织不冷冻，无冰晶形成也无组织抗原破坏，染色前又避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，故能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原。

振动切片主要用于显示神经系统抗原分布的研究。

对于柔软的胚胎脑组织，可用低熔点（45～55℃）10%琼脂糖包埋，振动切片机切成厚片（40～100μm），采用漂浮法在反应板内进行免疫荧光组织化学染色，激光扫描共聚焦显微镜观察。

3、防脱片处理步骤:

（一）载玻片和盖玻片的处理

（二）黏附剂的使用:

1.多聚赖氨酸（Poly-L-Lysin）首先配制0.1％（w/v）多聚赖氨酸浓缩液，室温下（18-26℃）可保存一年;

2.3-氨丙基-乙氧基甲硅烷（3-AminoAPES）APES必须现用现配。

（三）组织化学常见脱片原因:

1．组织固定、脱水、透明不充分。

2.组织切片过厚，如5μm以上。

3.组织切片有折叠。

4.过度的热抗原修复（高压、微波、水煮）处理或抗原修复液的pH值偏高。

5.操作过程中，冲洗方法不正确等。

第三章组织化学

第一节核酸组织化学

一、Feulgen反应是显示DNA的经典而特异的染色方法，由Feulgen（孚尔根）在1924年提出，因而得名。

原理:

DNA可在酸性条件下水解，嘌呤-脱氧核糖之间的糖苷键断开，形成醛基（一CHO），再用显示醛基的特异性试剂schiff试剂处理，形成光镜下所见的细胞核内紫红色反应产物。

2、吖啶橙染色吖啶橙（acridineorange，AO）属于三环杂芳香类异嗜性阳离子荧光染料,主要以两种方式与核酸结合，一是嵌入核酸双链的碱基对之间；

二是与单链核酸的磷酸间发生静电相互作用。

当吖啶橙与DNA或RNA结合时，产生绿色荧光或橙红色荧光。

可用于区分活细胞和死细胞少量细胞悬液与0.01%吖啶橙混合，活细胞核呈黄绿色荧光；

死细胞呈红色荧光，这是由溶酶体释放导致的

3、Hoechst33258染色原理：

Hoechst33258和Hoechst33342均为非嵌入性荧光染料，它们在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合，活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中摄取该染料,从而使细胞核着色,故又把此类染料称为DNA探针。

4、DAPI染色的原理：

DAPI与双链DNA小槽，特别是AT碱基结合，也可插入少于3个连续AT碱基对的DNA序列中;

特点：

荧光强度较Hoechst低，但稳定;

应用：

检测是否存在支原体污染，在有支原体污染的胞质和细胞表面可见孤立的点状荧光.

五、溴化乙啶和溴化丙啶染色法的原理：

溴化乙啶是最常用的嵌入式荧光染料，可用于活细胞或固定细胞的染色，标本经强酸水解破坏RNA，可特异性显示DNA为橘红色荧光；

标本经0.1mol/L盐酸处理，使DNA甲基化，可阻止DNA染色，EB仅与RNA结合呈橘红色荧光…溴化丙啶不能穿入完整的活细胞膜中，因此正常细胞和凋亡细胞在不固定的情况下对溴化丙啶拒染，可用于鉴别死细胞，DNA呈红色荧光

第2节脂类组织化学脂类（lipid）是构成细胞结构成分之一，可分为脂肪（fat）和类脂（lipoid）两大类。

脂肪系指甘油三酯，以脂滴形式存在于细胞质内。

类脂是一些与脂肪酸结合可形成酯的物质，包括胆固醇、固醇酯、磷脂和糖脂等。

在组织化学上，根据染色性质的不同可把脂类分为酸性脂类和中性脂类。

酸性脂类包括脂肪酸和磷脂等，中性脂类包括甘油三酯、胆固醇及固醇酯、类固醇及某些糖脂等。

一\酒精苏丹黑B染色法:

苏丹染色法常用染料有苏丹黑B（Sudanblack-B）、苏丹III和苏丹Ⅳ。

这类染料均可使中性脂肪着色。

苏丹黑B为重氮染料，能使中性脂肪呈蓝黑色，显示磷脂效果最好；

苏丹III、苏丹Ⅳ为红色染料，后者比前者显色更强。

二\油红O染色法:

油红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三脂结合呈小脂滴状。

脂溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，当组织切片置入染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质（如脂滴）中，使组织内的脂滴呈桔红色。

第3节酶组织化学

一、酶组织化学的基本原理和一般原则:

基本原理：

细胞内含有多种酶，每一种酶可催化一定的化学反应。

将具有酶活性的组织放入含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀，即最终反应产物。

酶组织化学对组织处理的基本要求

影响酶活性主要有以下5方面：

1.选择最适温度、pH值及缓冲液。

2．固定和切片标本制作由于固定液易使酶丧失酶活性，因此，最好用不固定的冰冻切片来显示酶活性。

切片厚度一般为8～12μm，不超过40μm。

3.捕捉剂和激活剂捕捉剂是形成最终产物的基本条件。

凡能提高酶活性的物质，称为激活剂。

4.抑制剂：

系指某些物质在不引起酶蛋白变性情况下，使酶活性减弱，抑制酶的活力，甚至使酶活性消失。

5.对照试验为确定被检酶是否具有特异性，同时要进行对照实验。

二、常用酶组织化学染色方法

（一）磷酸酶（phosphatases）是水解磷酸酯酶的总称。

磷酸酶不仅参与磷酸酯化合物的水解反应，而且也参与其逆反应及磷酸转移反应。

1．碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）在碱性环境下可催化各种酚和醇的磷酸酯水解，还具有磷酸转移作用，在细胞膜上运输作用较为活跃，如肾近曲小管的刷状缘、小肠上皮的微绒毛、肝脏的胆小管、毛细血管内皮细胞及神经元的突触膜均可显示此酶活性。

（1）钙-钴法：

在碱性环境（pH9.2~9.4）中，碱性磷酸酶将磷酸盐的底物（如β-甘油磷酸钠，α-萘酚磷酸钠）分解产生的磷酸离子被孵育液中的钙离子捕获生成磷酸钙沉淀，因磷酸钙不能显色，需加入硝酸钴，用钴离子置换钙离子，形成磷酸钴沉淀后用硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴颗粒沉淀，从而显示酶活性部位，硫化钴沉淀的多少与碱性磷酸酶含量成正比。

（2）偶氮-偶联法：

人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素。

2.酸性磷酸酶（acidphosphatase,ACP）广泛分布在机体各种组织细胞内，主要存在于细胞的溶酶体内，常作为溶酶体标志酶，此外，还存在于内质网和胞质内。

在组织退变、核酸和蛋白质代谢活动增加时酸性磷酸酶活性增强。

酸性磷酸酶还参与酯类代谢。

因此，它在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有一定生物学意义。

（1）金属盐—铅法：

其基本原理是在酸性环境下，底物β-甘油磷酸钠被酸性磷酸酶水解，释放出磷酸，磷酸遇铅离子则生成磷酸铅沉淀，最后与硫化铵作用形成棕黄色硫化铅沉淀。

（2）重氮盐后偶联法与碱性磷酸酶相同

3.葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase,G-6-P）定位于肝、肾、肠粘膜的微体及内质网内，主要有两方面的生理功能：

一方面通过水解葡萄糖-6-磷酸释放葡萄糖来控制葡萄糖释放入血的量，另一方面，在一定条件下通过其磷酸转移酶活性合成葡萄糖-6-磷酸。

糖尿病患者血糖浓度增高的同时，伴有葡萄糖-6-磷酸酶的磷酸转移酶活性增高，其作用是取代肝内的葡萄糖激酶，使葡萄糖转向糖原合成。

铅法：

葡萄糖-6-磷酸水解后所释放出磷酸，为硝酸铅所捕获，经硫化铵处理，最终反应产物为颗粒状的硫化铅沉淀。

第4节凝集素组织化学

凝集素（lectin）是一种无免疫原性蛋白质，可从植物或动物中提取，具有凝集红细胞的特性，故又称植物血凝素。

凝集素能特异地与糖蛋白中的糖基反应。

凝集素具有多价结合能力，能与多种标记物结合，可作为组织化学的特异性探针在光镜或电镜水平显示其结合部位，从而广泛用于糖蛋白的性质、分布以及正常细胞更新过程中糖蛋白变化的研究。

凝集素的标记物:

凝集素可作为组织化学的特异性探针广泛用于光镜的石蜡切片、冰冻切片、电镜树脂包埋超薄切片及冰冻超薄切片等标本的观察。

为使结合在细胞膜上单糖的凝集素呈现可视性，通常采用荧光素，辣根过氧化物酶、铁蛋白、胶体金、生物素等对其进行标记。

第5节荧光组织化学

荧光组织化学技术是利用荧光来鉴定组织细胞内某些生物化学成分、探讨细胞功能状态的常用方法。

组织细胞荧光分类:

（一）自发荧光:

（autofluorescence）系指不经任何处理的组织细胞成分，在短波长光照射下发出荧光，如胶原纤维和弹性纤维呈蓝绿色荧光，卟啉呈红色荧光，维生素A发绿色荧光，细胞内的脂褐素呈棕黄色荧光。

（二）诱发荧光:

是指生物胺类物质，如去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、组胺等与一些醛类物质在一定条件下发生环化或缩合反应，产生的缩合物可发出强荧光，称为诱发荧光。

诱发荧光法的敏感性较高、特异性强，广泛应用于神经递质、神经内分泌以及神经生物学等研究。

（三）酶促荧光:

指酶的反应产物能发荧光，如脱氢酶反应中的辅酶I变为还原型辅酶I后，发红色荧光。

因此可根据产物荧光强度推测酶与酶促反应的情况。

（四）荧光染色:

（fluorochromy）系指某些荧光染料在极低浓度下可与组织细胞的某种成分结合，发出不同波长的荧光，如吖啶橙可与细胞核中DNA结合，发出黄绿色荧光。

荧光染色的优点为敏感度高，所需染料浓度低，对细胞毒性小，可作活体染色，观察组织细胞的结构、组成和功能状态。

（五）免疫荧光

第四章、免疫组织化学技术

概念：

应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。

优点：

特异性强，敏感度高，应用广泛。

第一节免疫组织化学基本原理

一、直接法:

用酶或其它标记物标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原结合。

如标记物是酶，再加酶的底物，产生的有色产物沉积在抗原抗体反应的部位，即可检测。

优点：

简单快速，特异性强，非特异性反应低；

缺点：

敏感性差；

很难获得各种市售标记抗体。

（举例）敏感性：

一般情况，抗原抗体反应比例：

1:

6

二、间接法:

第一抗体（兔）不标记，使用与一抗种属相同抗体的Fc段（有种属特异性）作为抗原免疫动物（羊），制备抗抗体，即第二抗体（羊抗兔），并标记第二抗体。

染色时，顺次以第一抗体和标记的第二抗体处理标本，在抗原存在部位形成抗原-第一抗体-标记第二抗体复合物，以达到检测该抗原的目的。

间接法因第二抗体的放大作用敏感性大大增高。

三、亲和免疫组织化学

（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod，ABC法）1.生物素（Biotin）含硫的杂环单羧酸，分子量小,通过羧基与蛋白质的氨基结合，从而可标记抗体和酶。

2.亲和素（avidin）又称卵白素，糖蛋白，1个亲和素分子上有4个与生物素结合位点，故生物素与亲和素有很高的亲和力。

特点:

是将亲和素作为“桥”与生物素化的抗体和生物素结合的酶连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增加敏感性。

2.免疫组织化学酶类标记物

免疫组化标记物的酶结合在抗体或生物素上，制成酶标