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荧光量子点

荧光量子点在生物体内分子和细胞成像中的应用

[原文]XiaohuGao,LilyYang,JohnAPetros,FrayFMarshall,JonathanWSimonsandShumingNie.Invivomolecularandcellularimagingwithquantumdots.CurrentOpinioninBiotechnology2005,16,63–72.

量子点（QuantumDot）是一类具有纳米尺寸的发光粒子，它作为一类新的荧光材料被应用于生物分子和细胞成像中。

和传统的有机染料分子和荧光蛋白相比，量子点具有独特的光学和电子性质，如它具有发射光波长可调，高亮度，抗光漂白性以及多种量子点不同颜色荧光同时激发的优点。

目前已经开发出多功能的纳米微粒荧光探针就具有高亮度和生物体内稳定存在的特点。

在量子点的结构设计上，先在量子点基本结构的外围引入一层两性的共聚物外壳，然后再将这层外壳与肿瘤特异性识别配体或药物转运官能团相连。

带有聚合物外壳的量子点对细胞和动物是无毒的，但它们对细胞的长期毒性和降解机制还需要深入研究。

与生物组织相连的量子点为动物或是人体高灵敏多元细胞成像技术开辟了道路。

简介

半导体量子点在过去的20年里已经引起了广大科学工作者的兴趣，它表现出来的奇特的光学和电子性质是单个分子或是大尺寸的固体所没有的。

近来，纳米荧光量子点已经被用来作为荧光探针用于生物机理的研究，与传统的有机染料和荧光蛋白相比，它具有以下的优点：

通过调节量子点的大小和组成可以获得从红外到可见波长的荧光发射，而且它在比较宽的吸收波长范围内具有大的摩尔消光系数，它较其他类型的荧光探针具有高亮度和光稳定性的优点[1]。

因为它的宽吸收波长范围和窄发射波长，各种颜色和发射强度的量子点被用于生物体蛋白、基因序列和其他生物分子的研究[2-4]。

尽管荧光量子点具有相对大的尺寸（直径2-8nm），但现有的研究表明量子点荧光探针的行为与荧光蛋白（直径4-6nm）类似，而且从目前的荧光量子点的众多应用实例中还没有发现它在成键动力学和立体位阻方面存在问题[5-12]。

这样一个中等大小的纳米量子点，具有较大的表面积，并且自身带有可以与“诊断试剂”和“治疗试剂”相连的官能团。

此外，到目前为止，还未发现带有高聚物外壳的量子点对动物细胞有毒性。

在本文中，我们将展示一下近两年来荧光量子点的新发展以及它作为荧光探针在细胞成像中的应用，特别是多功能荧光量子点在活体肿瘤识别和成像中的应用。

读者想要了解更多的有关荧光量子点的报道，请参考以下几篇文献[1,13,14]。

量子点荧光探针的发展

量子点荧光探针的发展主要集中在它的合成、溶解性问题以及在生物学中的应用。

这种荧光粒子一般是由成百上千个第二副族和第六主族元素的原子（如CdSe和CdTe）或是第三副族和第五主族元素的原子（如InP和InAs）构成。

目前已经可以通过控制条件来达到对粒子直径、形状（圆点、棒状或四面体）[15－18]和内部结构的调控（母核－外壳、梯度合金、单一合金）[19-22]。

此外也可以合成二元素体系和三元素体系的荧光量子点。

通过调节粒子的大小和母核的化学组成，可以获得荧光发射波长从400nm到2000nm的量子点，荧光量子产率在室温下可以达到85％[23]。

性能优异的荧光量子点可以在有机溶剂中高温下制备，这些有机溶剂往往具有较高的沸点，并且常带有长的烷基链（如tri-n-octylphosphineoxide（TOPO）,hexadecylamine等）。

这些憎水的有机溶剂不仅仅是作为反应介质，更主要的是它们长碳链末端N原子或是O原子可以与量子点表面未配位饱和的金属原子作用，防止小粒子聚集形成大固体。

结果，在这些量子点母核的表面形成了一单层的有机溶剂分子保护层，并且憎水性的长碳链向外伸展；这样具有“包裹”粒子基本结构的量子点只能溶于一些非极性的溶剂（如氯仿）。

为了便于荧光量子点在生物成像中的应用，我们可以在憎水的量子点基本结构的外围引入一层两性的高聚物的外壳，使得它的水溶性增加；这样的两性高聚物往往由两部分组成，即憎水的长烷基链和亲水部分（可以是PEG或是多个羧酸官能团）。

许多类型的两性高聚物已经被报道[5,24,25,26]，如含有正辛胺长链的聚丙稀酸，PEG连接的磷酯、共聚物、聚酸酐等。

如Figure1所示,

Figure1多功能量子点荧光探针的结构。

这张示意图显示了量子点母核的TOPO保护层，两性高聚物层，恶性肿瘤识别配体（多肽，抗体和）小分子抑制剂，以及PEG连接单元。

两性高聚物上的憎水边链与量子点基本结构的TOPO发生强烈的憎水基相互作用，而高聚物上的亲水部分则裸露在外面，使得荧光量子点变成水溶性的。

荧光量子点基本结构中的TOPO仍旧紧紧地包裹在量子点母核的外面，将母核与外界环境隔离开，使量子点保持良好的荧光性能。

为了提高荧光量子点的生物目标识别能力，通常两性高聚物包裹的量子点与具有生物目标特异识别能力的单克隆抗体、多肽、寡核苷酸或小分子抑制剂相连。

通过PEG与其他配体相连可以提高量子点的生物相容性并减少它的非特异性标记。

荧光量子点与生物目标物的连接方式主要有被动吸附、多鳌合配位连接和共价连接（Figure2）。

两个常见的连接方式是碳酰亚胺-活化酯参与的酰胺键生成和马来酰亚胺参与的氨基与巯基的连接反应。

传统的酰胺键连接方式可以免去底物本身烦琐的化学修饰，因为大多数的目标蛋白本身都含有一定量的氨基和羧基官能团。

氨基和巯基连接方式的不利因素是含有游离的巯基的天然生物分子很少，而且在氧气存在下巯基也是不稳定的。

近来也有基于其他官能团连接策略报道。

Pellegrino等[26]报道了用包含酸酐官能团的两性高聚物来提高荧光量子点的水溶性，而量子点外层的酸酐官能团很容易与伯氨在没有缩合剂存在的条件下高效的反应。

因为包含酸酐官能团的高聚物是一类可以生物降解的高分子，所以它被广泛地应用于药物转运和组织工程研究[27,28]。

Figure2量子点与生物分子的连接方式：

a）EDAC参与的传统化学共价连接方式；b）通过SMCC参与的巯基与氨基还原偶联将抗体与量子点相连；c）通过受体蛋白将抗体与量子点相连；d）含有六组氨酸标签的多肽和蛋白与Ni-NTA修饰的量子点连接，定量定点。

目前，已经有很多的连接策略被发展，使得连接到带有两性高聚物外壳的量子点的配体分子能够定点地连接并且配体分子的数量可以控制。

但是配体分子在荧光量子点上的精确定位和数量还不能非常理想地调控。

Goldman小组[29]首先报道了一种连接策略，他们先在量子点上连接上一个融合蛋白，此融合蛋白上带正电的亮氨酸部分通过静电相互作用与带有负电的荧光量子点连接，然后蛋白上的免疫球蛋白G部分可以与抗体上的Fc部分相互作用而连接，而抗体上的具有特异目标识别作用的F（ab’）部分就裸露在量子点的外围（Figure2c）。

另外一种方法是先在量子点的外围连上一个NTA和Ni的鳌合物，然后这样一个Ni上未配位饱和的量子点可以与包含六组氨酸标签的生物分子通过配位作用连接（Figure2d）。

这种直接的基于六组氨酸标签的连接策略可以使得量子点定点地连接到目标分子上，紧缩了整个荧光探针的体积，有利于连接效率的提高，而且制备成本低廉（直接连接，纯化步骤简单）。

新颖的光学性质

根据前面的简要介绍，荧光量子点可以通过无机半导体材料制备。

它的优异荧光性质大大提高了荧光检测中的信噪比。

荧光量子点具有非常大的摩尔消光系数（0.5-5×106M-1cm-1）[30]，从而使它在照射有限的活体环境中较其他荧光探针显得更亮（活体环境中由于散射和吸收作用的存在大大削弱了激发光的强度）。

从理论上讲，荧光物质的激发态寿命决定了它的荧光发射速率，由于量子点的激发态寿命较长（20-50ns），所以它的荧光发射速率约为传统的有机染料的1/5-1/10。

实际上，荧光成像技术通常是在受限激发的条件下操作的，这样的话，荧光发射强度主要取决与荧光物质对激发光的吸收。

因为荧光量子点的紫外消光系数（5-10×104M-1cm-1）大约是有机染料的10-50倍，因而导致在同样的激发条件下它的紫外吸收速率是有机染料的10-50倍，因此它的荧光发射强度为有机染料的10-20倍[31,32]（Figure3a）。

此外，荧光量子点的抗光漂白能力也较有机染料强几千倍，因此它特别适合作为长时间连续跟踪成像的荧光材料（Figure3b）。

由于荧光量子点具有较长的激发态寿命，所以通过时间控制的成像技术可以将量子点发射的荧光很方便地从背景荧光中区别出来[33,34]。

如Figure3c所示的是有机染料和荧光量子点荧光发射强度随时间的衰减曲线，假设荧光量子点和有机染料同时受到激发，并且假设两者初始的荧光发射强度相同，荧光量子点的激发态寿命是有机染料的10倍，那么我们就会观测到从0-10ns的极短时间内，两者的荧光发射强度比IQD/Idye从1增加到100。

因此,在这样一个体系中运用时间延迟数据采集技术，可以使得获得的图像的对比度（信噪比）显著地提高。

Figure3荧光量子点的奇特光学性质。

a）三种相同摩尔浓度的荧光物质TRITC,绿色量子点，红色量子点在正常光照条件下的荧光现象。

因为量子点具有较大的紫外消光系数，它表现出了的荧光较有机染料强；b）相同光激发条件下，量子点表现出是有机染料几千倍的抗光漂白能力；c）量子点和普通有机染料激发荧光衰减曲线比较。

由于量子点较长的激发态寿命，使得时间控制的成像技术得以运用，并将背景荧光噪音降至最低。

τdye和τQD是当荧光发射强度下降到原来的1/e的弛豫时间；d）在同一激发光条件下，老鼠皮肤背景荧光发射图和体内含有量子点的老鼠荧光发射图。

（在扣除老鼠本身皮肤背景荧光发射后，可以得到量子点的荧光发射图）。

荧光量子点具有极大的Stokes位移，它有利于检测灵敏度的提高。

在体内生物分子成像中，往往会有很强的背景荧光，干扰正常的检测过程，而量子点这一光学特性可以使它的发射荧光和背景荧光通过基于波长检测技术区别出来。

从Figure3d可以看到，荧光量子点的Stokes位移在不同的激发光下可以达到300-400nm，而以往的有机染料因为Stokes位移较小，所以在检测中它发射的荧光往往会被淹没在背景荧光中。

荧光量子点探针具有较强的“颜色对比度”，所以通过基于波长的成像技术可以得到信噪比极高的图像[25]。

另外一个显著的优点是，不同颜色的荧光量子点可以被用来同时检测几个不同的目标分子。

这对于生物检测来说是非常有利的，因为人类疾病如癌症、动脉硬化往往牵涉到一系列的基因和蛋白。

跟踪一系列的荧光标记分子可以让科学工作者理解、分类和区别复杂的人类疾病[35]。

多维成像技术中，核磁共振成像技术、正电子发射成像技术、X-ray成像技术以及相关的成像设备的技术要求非常高；而相对简便的荧光成像技术不仅可以提供荧光强度和波长的信息，而且可以进行多波长同时成像（彩色成像），不同分子和细胞可以用不同颜色的荧光量子点来标记。

从这个技术讲，荧光量子点显得特别有优势。

通过调整量子点的大小和化学组成，可以得到不同颜色荧光的量子点，同时由于它们具有宽的紫外吸收曲线，允许了多种颜色荧光量子点的同时激发成像技术。

也有文献报道，毫米级的荧光量子点嵌入到聚合物珠子中，用于生物器官和血管的多元分子成像[35-40]。

体内分子和细胞成像

细胞成像和跟踪

因为荧光量子点的制备方法、表面修饰手段和生物连接技术的发展，它被广泛地应用于高灵敏的多颜色细胞成像技术中（Figure4）。

Wu等[5]将带有表面高聚物外壳的荧光量子点与链亲合素相连运用共焦显微镜观测到了细胞的骨架结构。

由于荧光量子点对光的稳定性，它可以被运用在细胞的连续平面成像和高清晰的三维成像。

由于荧光量子点的高电子密度，它可以被用来进行细胞结构的光学电子成像[41]。

更进一步，Dahan和Jovin等人[6,7]将荧光量子点用于单分子的实时成像检测，这样的工作是很难通过有机染料来实现的。

一旦能够实现体内单分子实时检测，它将为受体扩散动力学、配体受体相互作用、生物分子转运、酶活性以及分子马达等研究开辟广阔的道路。

Figure4量子点用于细胞和生物组织成像。

a）绿色量子点标记的3T3纤维原细胞；b）含有抗体的红色量子点特异性识别尿激酶血浆酶子源用于体内MDA-MB-231乳腺瘤标记；c）用连有Tat多肽的量子点对哺乳动物细胞进行标记；d）用能特异性识别CXCR4受体的量子点以及细胞核绿色染料实现对冰冻组织标本的标记量子点用于体内目标识别和成像。

Figure5量子点用于体内目标识别和成像。

a）荧光量子点标记的老鼠肺中的癌细胞；b）具有近红外发射波长，水溶性的第二类型的量子点被淋巴结吸收；c）包含各种量子点的不同颜色的微珠被注射到老鼠体内用于活体成像；d）用包含抗体的红色量子点进行老鼠活体内前列腺癌细胞的特异性标记和成像。

Dubertret等[24]将带有PEG化磷酯外壳的量子点注射到青蛙胚胎，这个有PEG外壳的量子点在胚胎环境中是高度稳定的，并且在4天之内没有发现细胞排异现象[24]。

这种光稳定的荧光量子点已经被应用于细胞和生物分子长时间的实时跟踪[6,7,9]。

将荧光量子点注射到老鼠体内，它迅速被老鼠淋巴结吸收，而且此荧光点在老鼠体内一直被观察到，长达4个月之久[42]。

荧光量子点也被作为荧光标签，用于活细胞的的成像（Figure4c）[24,25,43,44,45,46]。

量子点进入活细胞主要有以下三种方式：

非特异性的胞饮作用、肌肉注射、和多肽诱发的转运（例如，Tat-PTD[25]）。

令人惊讶的是，20亿个荧光量子点可以被同时引入到一个细胞的细胞核中，而没有影响此细胞的正常分裂、繁殖和运动能力[24,44,47]。

单细胞的实时运动成像可以被应用于诸多重要的研究，如胚胎基因学、癌细胞转移、神经元细胞治疗、淋巴免疫学等。

淋巴结和血管成像

荧光量子点已经被报道用于淋巴结和血管成像（Figure5a-c）。

Ballou小组[42]将含有PEG外壳的量子点注射到老鼠血液，然后观察量子点母核外面的这层高聚物外壳对它在血液循环系统中停留时间的影响。

有机小分子染料在刚注射完后的几分钟就从血液循环系统中被清除，而带有高聚物外壳的荧光量子点在血液中的半保留时间超过了3小时。

这种现象是由这个带有PEG外壳的量子点的结构所决定的，它的尺寸正好在一个合适的范围内，它们足够小而且又是水溶性的，使得血液的清除作用以及网状内皮组织的过滤作用对它不能有效作用，而且它们的尺寸又是足够大而躲避了肾脏的过滤作用。

Webb组[48]利用此有趣的性质，用荧光量子点进行了微血管的双光子成像，他们发现量子点的双光子吸收的交叉区域比传统有机染料大两到三个数量级。

为了提高量子点的组织渗透性，Kim等[49]制备了第二类型的荧光量子点，它在850nm处有相当宽的荧光发射，中等的荧光量子产率13％。

和第一代量子点相比，第二代的量子点的屏蔽材料的价键能和导带能都低于本身的母核，所以使得母核的电子和空穴的间隔变大，发射荧光的能量降低。

这样的量子点更容易被淋巴结吸收，它被用于生物淋巴结的高清晰成像。

量子点荧光探针能被应用于体内的实时成像，外科医生在量子点成像提供的可视化依据的指导下，能够准确，迅速地定位和切除病变的组织。

目前，还没有高效的红外发射区的量子荧光点的制备方法。

现有的大多数荧光量子点材料（PdS,PdSe,CdHgTe和CdSeTe）或是因为不够亮，或是因为对光不够稳定而不能作为生物成像的理想材料。

所以现在迫切需要研究一类具有红外或是远红外发射的足够亮而且光稳定的荧光量子点。

Lim等[50]已经在理论方面进行了预测，他认为在活体成像技术中，荧光发射在700-900nm和1200-1600nm这两种波段的荧光物质是最合适的。

恶性肿瘤的识别和成像

Akerme等[51]首次报道了将荧光量子点连接多肽后再连接到恶性肿瘤的血管上，但是这样的荧光探针在体内没有被检测到。

虽然这样，以前的体外研究结果表明荧光量子点能够通过活性多肽连接到恶性肿瘤的血管上，它可以避免网状内皮组织的清除。

近来，Gao等[25]报道了一类新的多功能的量子点荧光探针用于恶性肿瘤的活体成像。

这类量子点包含了一层两性的共聚物外壳，这层外壳具有自身保护的作用，它上面连有对恶性肿瘤抗原特异性识别的配体，能够高效识别恶性肿瘤；外壳上的PEG则可以提高量子点的生物相容性。

两性的高聚物外壳阻止了量子点荧光探针微粒的相互聚合，也防止了在生物缓冲体系中荧光性质的丧失[51,52,53]。

更深入的量子点荧光探针的生物体内的行为也被报道，包括了它们在生物体内的分布、非特异性地被吸收、细胞毒性和代谢动力学。

在生物活体内，量子点荧光探针定位于恶性肿瘤体，可以通过两种机制进行，即被动识别机制和活性识别机制。

在被动识别机制中，纳米尺寸的量子点通过它的高渗透性和保留性在肿瘤细胞中被大量富集[54,55]。

它主要是由两方面的原因引起的，血管基因恶性肿瘤它会产生一种促成血管内皮组织生长的物质，使得恶性肿瘤上的新生血管系统的渗透性加强，也就使得大分子或小粒子容易漏进来富集。

其次，恶性肿瘤缺乏淋巴清除能力，导致了大分子或是纳米量子点的富集。

而主动识别机制则可以通过以下的例子说明。

据报道，PSMA是前列腺上皮细胞的重要组成，也是新生血管系统内皮细胞的主要组成[56]。

当前列腺出现癌变的时候，它周围的PSMA浓度就会增加，相应的就会引起体内PSMA抗体在前列腺部位的富集和保留。

在医学上，这也是进行成像、放疗、化学介入治疗的依据[57,58]。

Gao等[25]制备了一类荧光量子点，它本身带有PSMA的抗体，它与前列腺恶性肿瘤上的PSMA特异作用，实现了对恶性肿瘤的识别和标记监测（Figure5d）。

生物毒性和潜医疗用途

荧光量子点的生物毒性问题已经收到越来越多的关注。

它的活体生物毒性决定了量子点能否成为人类疾病治疗常规探测试剂。

Derfus小组[59]的研究表明，CdSe组成的量子点在长时间紫外光照射下对细胞具有高毒性。

这是因为紫外光的能量跟共价键的键能非常接近，使得量子点在光照射下发生了光解反应，释放出了高毒性的Cd离子。

如果没有紫外光的激发，含有高聚物外壳的量子点在生物环境中是非常稳定的。

它对生物体无毒（对细胞分裂和ATP的产生没有影响），Ballou等[42]在对量子点进行了活体研究时证实了带有高聚物外壳的荧光量子点对生物是无毒性的。

但是量子点荧光探针对生物体的细胞毒性和活体中的降解机理尚有待深入研究。

对于量子点，生物体的化学和酶降解是不大可能发生的，但是带有高聚物外壳的量子点可能可以通过生物体的慢过滤和排泄作用排出体外。

量子点在体内的代谢机理在进行人体应用以前是一定要搞清楚的。

总结

量子点已经被作为一类新型分子成像试剂用于生物成像。

通过量子点外层的高聚物包裹层的合理设计，它已经成为一类多功能的纳米发光材料，通过将荧光量子点和顺磁或逆磁的物质结合，它成为了一类多用途多维成像探针。

近来，科学家们实现了将它与氧化铁和FePt纳米微粒以及顺磁性的钆鳌合物相结合的应用[60,61]。

利用磁共振成像中的深度成像和紫外光学成像联用，外科医生能够可视化地识别出微小肿瘤和损伤组织，并准确地将它们切除。

磁共振成像和正电子发射光谱能够识别疾病部位，但是它们没法为外科医生提供直接的可视化向导；而具有磁活性和光活性的量子点正好解决了此问题。

另一个量子点的应用是将它们与某种药物相连，从而跟踪药物在体内的代谢过程，而且病变组织也可以通过实时成像技术被监测。

令人惊讶的是，量子点它本身还具有光动力学治疗试剂的活性[62]。

上面所提到的只是量子点应用前景的一部分。

实际的量子点在生物医学中的应用将会被继续开展，通过各种学科技术的交叉应用，它将会在纳米技术和生物医学治疗中具有远大的应用前景。

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