基因工程步骤.ppt

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一、学习目标一、学习目标简述基因工程原理及基本操作过程简述基因工程原理及基本操作过程二、学习重点和难点二、学习重点和难点11、基因工程基本操作程序的四个步骤（重点）、基因工程基本操作程序的四个步骤（重点）22、从基因文库中获取目的基因（难点）、从基因文库中获取目的基因（难点）33、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因（难点）技术扩增目的基因（难点）1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区编码区下游编码区下游编码区下游编码区下游调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达调控遗传信息的表达（调控序列调控序列调控序列调控序列）外显子外显子外显子外显子（能编码蛋白质能编码蛋白质能编码蛋白质能编码蛋白质）内含子内含子内含子内含子（不能编码蛋白质不能编码蛋白质不能编码蛋白质不能编码蛋白质）启动子启动子终止子终止子非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子1122334455转转录录mRNAmRNA前体前体成熟成熟mRNAmRNA加加工工切除内含子转录部分切除内含子转录部分原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能编码蛋白质，能编码蛋白质基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取用用33分钟阅读分钟阅读P8-11P8-11，并思考下列问题，然后用，并思考下列问题，然后用22分钟与同桌交流、讨论。

分钟与同桌交流、讨论。

11、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?

22、何谓基因文库？

其类型有哪几种？

、何谓基因文库？

其类型有哪几种？

33、如何构建基因文库？

、如何构建基因文库？

44、何谓、何谓PCRPCR技术？

其原理、条件和过程是怎样的？

技术？

其原理、条件和过程是怎样的？

一、目的基因的获取一、目的基因的获取11、目的基因：

主要指的是编码蛋白质的、目的基因：

主要指的是编码蛋白质的结构结构基因基因，也可以是一些具有调控作用的因子。

，也可以是一些具有调控作用的因子。

22、获取方法：

、获取方法：

（11）从基因文库中获取目的基因；）从基因文库中获取目的基因；（22）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因；技术扩增目的基因；（33）通过）通过DNADNA合成仪用化学方法直接合成合成仪用化学方法直接合成33、基因文库、基因文库又称又称DNADNA文库，将含有某种生物不同基因的许多文库，将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段，导片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，所有受体菌的集合即为该生物的基因文库。

的基因，所有受体菌的集合即为该生物的基因文库。

基因文库由基因文库由外源外源DNADNA片段、载体片段、载体和和宿主宿主组成。

组成。

按外源按外源DNADNA片段的来源分基因文库分为：

片段的来源分基因文库分为：

基因组基因组DNADNA文库：

包含了某物种的所有的基因文库：

包含了某物种的所有的基因部分基因文库：

只包含了部分基因文库（如部分基因文库：

只包含了部分基因文库（如cDNAcDNA文库）文库）11）载体）载体DNADNA片段的制备片段的制备DNADNA分离纯化分离纯化限制酶切限制酶切22）供体）供体DNADNA片段的制备片段的制备总总DNADNA分离纯化分离纯化酶切法酶切法分离特定大小分离特定大小DNADNA片段片段33）载体与基因组）载体与基因组DNADNA片段的连接片段的连接44）重组）重组DNADNA转化受体细胞转化受体细胞4.4.基因文库的构建基因文库的构建基因组文库的构建基因组文库的构建通过对受体菌通过对受体菌的培养而储存的培养而储存基因基因cDNAcDNA文库的构建文库的构建（反转录法）反转录法）目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA（DNA（目的基因目的基因）接到载体接到载体基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较文库类型文库类型文库类型文库类型cDNAcDNA文文文文库库基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小文库大小文库大小基因中启动子基因中启动子基因中启动子基因中启动子基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因多少基因多少基因多少基因多少物种间基因交流物种间基因交流物种间基因交流物种间基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以思考：

思考：

怎样从基因文库中得到我们所需的目的基怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？

因？

根据基因的有关信息如根据基因的有关信息如根据基因的转录根据基因的转录产物产物mRNAmRNA、基因的核苷酸序列、基因翻译产、基因的核苷酸序列、基因翻译产物蛋白质物蛋白质等来获取目的基因。

等来获取目的基因。

22、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR概念概念：

PCRPCR全称为全称为_，是一项在生物，是一项在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术条件：

条件：

___、__、_原理：

原理：

_方式：

方式：

以以_方式扩增，即方式扩增，即_（nn为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）结果：

结果：

聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA双链复制双链复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列（前提条件前提条件）四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸成对引物成对引物DNADNA聚合酶聚合酶（Taq（Taq酶）酶）指数指数22nn使目的基因的片段在短时间内成百万使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增倍地扩增过程：

过程：

aa、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：

双链）：

双链DNADNA模板模板在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_bb、退火（、退火（复性复性55-6555-65）：

系统温度降低，引物）：

系统温度降低，引物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。

cc、延伸（、延伸（70-7570-75）：

在）：

在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。

氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCRPCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性90-9590-95CC延伸延伸70-7570-75CC退火退火55-6055-60CCPCRPCR总结：

总结：

33、化学方法人工合成目的基因、化学方法人工合成目的基因基因比较小基因比较小,已知核苷酸序列，直接利已知核苷酸序列，直接利用用DNADNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。

合成仪用化学方法合成，不需要模板。

蛋白质蛋白质的氨基的氨基酸序列酸序列mRNA的核苷的核苷酸序列酸序列基因的基因的核苷酸核苷酸序列序列目目的的基基因因推测推测推测推测化学化学合成合成从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：

获取目的基因的方法归纳：

获取目的基因的方法二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心质粒质粒DNADNA分子分子一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种限制酶限制酶目的基因与运载体的结合过程，实际上是目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。

不同来源的基因重组的过程。

11、基因表达载体的构建方法、基因表达载体的构建方法2.2.基因表达载体的目的基因表达载体的目的（11）使目的基因在受体细胞中稳定存在）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代并可以遗传给下一代（22）使目的基因能够表达和发挥作用。

）使目的基因能够表达和发挥作用。

33、基因表达载体的组成：

、基因表达载体的组成：

aa、目的基因、目的基因bb、启动子启动子cc、终止子、终止子dd、标记基因等、标记基因等思考：

它们有什么作用？

表达载体为什么一定要有启动子？

表达载体为什么一定要有启动子？

（11）生物之间进行基因交流，只有使）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达。

利于基因的表达。

（22）通过）通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。

胞无法转录。

终止子的作用是什么？

终止子的作用是什么？

终止子是位于基因尾端的一段终止子是位于基因尾端的一段特殊的特殊的DNADNA片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的转录。

的转录。

是为了鉴别受体细胞中是否含有目是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。

出来。

标记基因有什么作用？

标记基因有什么作用？

11、原理：

、原理：

借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞22、方法、方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞

（1）农杆菌转化法特点：

特点：

易感染双子叶植物和裸子植物，易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能对大多数单子叶植物没有感染能力力原理：

原理：

TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，并整可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的合到受体细胞染色体的DNADNA上。

上。

转化过程:

TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌基因枪法又称微弹轰基因枪法又称微弹轰击法，是击法，是利用压缩气体利用压缩气体产生的动力产生的动力，将包裹在，将包裹在金属颗粒表面的表达载金属颗粒表面的表达载体体DNADNA打入受体细胞中打入受体细胞中，使目的基因与其整合并使目的基因与其整合并表达的方法。

表达的方法。

（2）基因枪法单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物适用此方法适用此方法适用此方法适用此方法（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。

花粉管通道法直通胚囊。

花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加剪去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

进入受体细胞。

适用于适用于适用于适用于被子植物被子植物被子植物被子植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊22、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞程序：

程序：

目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射受精卵受精卵新性状动物新性状动物方法：

显微注射法方法：

显微注射法微生物