流式细胞仪上机培训手册Word文档格式.docx

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106个细胞/管),分别加到已经标记好的流式管底部;

4)洗涤。

加入1mlPBS/管,涡旋1600rpm/min,离心6min;

5)染色。

弃上清,加入100μlPBS/管涡旋混匀细胞,并根据实验设计,向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体,混匀,室温避光孵育30min(操作尽量保持在避光条件下进行。

6)洗涤。

7)重悬。

弃上清,加入0.5mlPBS/管,混匀,上机检测(可选择BDFACSCantoII或BDAccuriC6)。

(注:

若不能及时上机,应加入4%多聚甲醛固定,并于4℃避光保存。

8)试验结果分析。

(注:

实验过程中如果进行多色标记,需要调节荧光补偿)。

参考值:

CD3+

60.8-75.4%

CD4+

29.4-45.8%

CD8+

18.2-32.8%

NK(CD3-CD56+)

9.5-23.5%

 

二、上机检测

BDFACSCantoII简要操作流程

启动流式细胞仪

1打开流式细胞仪电源

2启动计算机,打开软件登录

3确保软件连接到流式细胞仪

必要时,点击Cytometer>

connect

检查液体水平

1启动流式细胞仪后,检查液体水平

低液面水平或者废液桶满都用红色指示。

2如果液流车未自动开启,选择Cytometer>

FluidicsStartup。

3当液流启动完成后,点击OK关闭对话框。

检查气泡

1在检查完液体水平后,开启流动室门,检查流动室中是否有气泡。

2如果没有看到气泡,进行第5步。

如果看到气泡,点击Cytometer>

CleaningModes>

De-gasFlowCell.

3当完成信息出现后,点击OK。

4如果还可以看到气泡,重复上述操作。

注意:

如果打开流动室细胞进口门时出现错误信息,通过关闭进口门,并等待30秒关闭该信息。

5当您完成上述操作后,在往下进行之前请先检查激光预热是否已经完成。

创建实验

1按照需要,在工作区工具栏中点击相应的按钮来显示浏览器、细胞仪、检测器、工作表、获取控制板和双指数编辑器窗口。

2创建文件夹:

A在浏览器中选择数据库图标,并点击浏览器工具栏上的NewFolder。

B对该文件夹命名。

3选择该文件夹,点击NewExperriment来创建一个新实验。

4对该实验进行重命名。

5选择实验级别的细胞仪设置,然后点击Inspector(检测器)中的Parameters(参数)选项卡。

6按照需要变更,添加或者删除参数。

运行样本并记录数据

1将样品管安装到流式细胞仪中并点击AquireData(获取数据)。

A把抽吸臂向左侧推。

B把流式管放置到SIT上,确保试管竖直,并用力向上推试管直到试管完个停止并完个就位。

C把抽吸臂放置到试管下的中心位置。

抽吸臂上有3个传感器引脚。

试管底部应定位在

这些引脚的中心位置内。

2调节FSC和SSC电压以正确显示细胞的散射光特征。

3必要时,点击阈值图标并对FSC阈值进行调节。

4调节P1门仅围绕目的细胞群体。

5调节好后,点击RecordData(记录数据)以记录数据。

6获取停止,取出试管。

建立全局工作表

1如果用户参数中启用了Defaultglobalworksheet(默认个局工作表)(默认选项),则全局工作表已经存在。

展开全局工作表文件夹来定位和重命名工作表。

如果Defaultglobalworksheet被禁用,则通过点击浏览器工具栏中的NewGlobalWorksheet(新个局工作表)按钮创建个局工作表。

2使用设计对话框定义参数标记并指定各个试管要记录的细胞颗粒数。

标记会出现在点图轴上和所有的统计结果图中。

A选择Experiment(实验)>

ExperimentLayout(实验布局)。

B在Labels(标签)选项卡中,为试管输入适当的标签。

例如,在FITC域中输入CD3。

使用Tab键移动到下一个域。

3在该全局工作表中,创建用预览数据的点图。

例如:

创建PerCP-Cy5.5对SSC,FITC对APC,FITC对PE,FITC对PE-Cy7和FITC对APC-Cy7点图。

设门

通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。

如:

PBMC样本是混合细胞群,如果想单独分析淋巴球细胞,可根据FSC或细胞大小,在FSC,SSC的散点图中设门,其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。

关机

1选择Cytometer(细胞仪)>

FluidicsShutdown(液流关闭),并遵循所有的提示。

2关闭细胞仪电源。

3退出BDFACSDiva软件。

C6简要操作流程

开机

1.打开电脑,上样处放置一管双蒸水

2.打开C6仪器,其自动执行“startup”,时间约5min,期间禁止开盖

3.当软件显示仪器状态为“CytometerConnectedandready”并亮绿灯时,则可以上样

4.(推荐用质控微球上机,FL1-H和FL2-H直方图中必须有八个峰,FL3-H中必须有6-8个峰,即仪器分辨率CV值满足标准)

采集样品

1.样品震荡混匀后置于上样二档处

2.设置流速,采样数目或时间或体积

3.点击“DotPlot”或“Histogram”或“DensityPlot”,选择需要的图形

4.点击坐标轴参数,从下拉菜单中选择需要的参数(如:

“FL1-A”“FSC-A”)

5.点击“PlotSpec”,选择“linear”或者“log”,设置坐标轴显示范围

6.右击坐标轴参数,选择“RenameParameters”,进行坐标轴重命名

7.选择“Display”中的“EventsDisplaySettings”,选择显示的细胞数

8.选择样品位置,点击“run”,进行采样

9.取下样品

10.取新的流式细胞管置于上样针处,点击“backflush”,清洗上样针

11.样品命名

12.点击“ZoomIn”,放大指定区域,设置阈值。

点击“ZoomOut”,返回放大

1.在图像下方点击设门工具,圈定指定区域,设置为门

2.点击相应图像上方的“Gate”,选择该图像需要应用的门

设置补偿

若样本是双荧光或三荧光检测,则实际图像显示中会用到荧光补偿

1.点击“SetColorCompensation”

2.选择需要补偿的荧光参数,输入补偿值,点击“Save&

Close”

分析统计

点击“Statistic”

可选择预览选择的样品图形,所有的Plot列表。

所有的Plots,Gates以及统计学的列表,从中选择需要显示的信息

关机清洗

1.放置一管去离子水,运行2min,清洗时<10Events/sec才算干净

2.放置一管0.5%-1%有效氯的清洗液,运行2min

3.放置一管去离子水,运行2min,运行结束后去离子水保留在上样处

4.退出软件,关闭电脑

5.关闭电源键(按住时间小于5秒钟),仪器自动Shutdown,时间约为13min,完成后仪器电源键自动关闭

三、数据分析

略。

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