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1.1实验材料与器材2
1.1.1实验样品2
1.1.2实验试剂2
1.1.3实验仪器3
1.2研究方法4
1.2.1培养基的配制4
1.2.2样品的采集5
1.2.3菌株的分离与筛选5
1.2.4形态学鉴定5
1.2.5微生物大小的测定6
1.2.6菌种纯化6
1.2.7环境因素对微生物的影响7
1.2.8基因组DNA提取7
1.2.9琼脂糖凝胶电泳7
1.2.10PCR扩增8
1.2.11从凝胶中分离回收DNA的方法8
1.2.12重组子的构建、转化与筛选9
1.2.13重组型纤维素分解菌株的验证10
2实验结果10
4讨论11
5结论12
[参考文献]13
引言
纤维素是自然界中存在的最廉价、最丰富的天然可再生资源,存在许多高能氢键,因此其水解、利用较困难,利用微生物分解纤维素能够节省资源又减少对环境造成的污染。
纤维素是碳源营养物质，已知的分解纤维素的真菌有野生型的曲霉、青霉、木霉等，细菌有纤维素单胞菌、纤维弧菌，在有氧条件下起分解纤维素作用的主要是真菌，可利用这些特点设计筛选方案。
天然纤维素原料是地球上最丰富的可再生有机物质。
全世界通过光合作用产生的植物物质每年高达2000亿t，目前有89％未被人类利用，只有11％用作饲草、造纸和建筑原料。
绝大部分的天然纤维素原料在自然环境中被各种微生物分解转化，最终形成CO2和H2O。
虽然这是生态系统中碳循环的一个重要环节，但从人类利用自然资源的角度看，无疑是巨大的浪费。
在我国，大部分秸秆和树林副产品被用作燃料或在田间被直接烧掉，不但破坏了生态平衡，污染环境，还存在火灾隐患。
发展和利用生物技术分解转化天然纤维素原料既是资源利用的有效途径，而且对于解决环境污染、粮食短缺和能源危机也具有重大的现实意义。
纤维素分解菌分为降解纤维素细菌、降解纤维素放线菌、降解纤维素真菌。
生物降解纤维素研究进程中有待解决的问题：
①目前用于生产纤维素酶的菌株多为木霉、青霉和曲霉等，普遍存在酶活力较低的问题。
筛选高效纤维素分解菌是利用秸秆纤维素的关键。
②纤维素酶价格贵，利用成本高，要使纤维素酶真正能够应用于生产，必须设法降低纤维素酶的成本，如筛选新菌株，改善生产工艺等。
③酶产量及酶的比活力低一直是影响纤维素酶实际应用的重要原因。
目前，纤维素酶形成的机制和原理还未完全搞清楚。
因此通过实验研究确定最适产酶条件具有重要意义。
通过分子生物学的技术手段提取产纤维素酶的基因进行PCR扩增、DNA转化转染，整合到受体菌株上，从而得到能分解纤维素的重组型菌种，为生物降解纤维素研究做贡献。
1材料与实验方法
1.1实验材料与器材
1.1.1实验样品
本实验的样本材料取自大庆师范学院生命科学学院实验楼门前花圃土壤。
1.1.2实验试剂
表1主要使用试剂
试剂名称
产地
NaCl
天津市巴斯夫化工有限公司
95%酒精
天津市富宇精细化工有限公司
牛肉膏
北京奥博星生物技术有限责任公司
酵母粉
北京市海淀区微生物培养基制品厂
琼脂
福建泉州市泉港化工厂
生理盐水
蛋白胨
天津市天力化学试剂有限公司
甲基红
上海化学试剂采购供应站
HCl
氢氧化钠
锦州古城化学试剂厂
孔雀绿
番红染液
KNO3
K2HPO4·
3H2O
MgSO4·
7H2O
KH2PO4
Taq聚合酶
溶菌酶
BufferGPS平衡缓冲液
BB
TAE电泳缓冲液
pBlueFree-TTA克隆载体
DH5α感受态细胞
LB液体
氨苄青霉素Amp
氯仿
异戊醇
异丙醇
1.1.3实验仪器
表2主要仪器设备
名称
型号
目镜测微尺
镜台测微尺
电子天平
广州市正一科技公司
FA2004N
超净工作台
哈东联电子技术开发有限公司
BNQ-1360
生物显微镜
麦克奥迪
SFC288
全温振荡培养箱
HZQ-F160
恒温培养箱
高压灭菌锅
TOMYKOGYOCO..LTD
ES-315
微波炉
格兰仕微波炉电器有限公司
WD800G
PCR扩增仪
离心机
电泳仪
移液枪
EP管
紫外透射检测仪
SPW洗涤柱子
水浴锅
冰箱
紫外分光光度计
HibindDNA结合柱离心柱
注：
三角瓶，镊子，试管，平板，烧杯，PH试纸等基本仪器略，需要灭菌的仪器高压蒸汽灭菌，121℃20min
1.2研究方法
在校园里取落叶等纤维素含量丰富的土样品，采用稀释法和平板三区划线在选择培养基上挑取单菌落，并进行细菌的分离和纯化。
对分离出的菌种进行简单的革兰氏染色、芽孢染色、霉菌染色及大小测定初步对其进行分类鉴定。
实验改变条件研究了解化学因素、物理因素、生物因素对微生物生长的影响有助于跟好的培养纤维素分解菌。
利用分子生物学的技术手段提取产纤维素酶的基因进行PCR扩增，电泳检测后回收目的基因，把目的基因与载体连接并整合到受体菌株上，从而得到能分解纤维素的重组型菌种。
1.2.1培养基的配制
（1）选择培养基
表3选择培养基
纤维素
5g
酵母膏
0.5g
水解酪素
NaNO3
0.5
1g
0.9g
蒸馏水
KCl
Na2HPO4.7H2O
1000ml
1.2g
MgSO4.7H2O
（2）葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基
表4葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基
葡萄糖
10g
3g
20g
pH
7.0-7.2
•注：
培养基高压蒸汽灭菌，121℃20min
1.2.2样品的采集
在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约5g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
1.2.3菌株的分离与筛选
称取土样样品约5g，加入到一个盛有30mL无菌水并带有
玻璃珠的三角瓶中，将样品充分打散混合混均10min，静止取上清，消毒步骤后，用接种环接种在选择平板培养基上，三区画线，封口，写好相应编号，倒置于28℃恒温培养箱中培养3-5天，长出菌落可初步鉴定为能降解纤维素的菌。
1.2.4形态学鉴定
1、革兰氏染色
（1）制片，取活跃生长期的菌种进行涂片、干燥和固定。
（2）初染，滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1~2min后倾去染液，水洗至流出水无色。
（3）媒染，先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
（4）脱色，将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色，当流出液无色时立即用水洗去乙醇。
（5）复染，将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。
油镜观察。
2、芽孢染色
制片---干燥----固定----染色（孔雀绿加热5min）----水洗-----复染（番红染液2min）----水洗---镜检
3、霉菌染色观察
在载玻片上加一滴美蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50％乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。
盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。
挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；
加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。
1.2.5微生物大小的测定
1、校正目镜测微尺
1）放镜台测微尺
2）校正：
对准焦距转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。
3）计算：
因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度
目镜测微尺每格长度（µ
m）=（镜台测微尺格数×
10）/目镜测微尺格数
2、菌体大小的测定
校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌标本片，低倍镜下找到标本后，换油镜测定球菌的直径和杆菌的长和宽。
测定时，测出细菌直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。
最后将所得的格数乘以每个代表的长度，即为该菌大小。
一般测3-5个菌。
3、测定完毕，整理。
1.2.6菌种纯化
采用三区划线法进行分离，在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/ml的刚果红溶液，10-15min倒去，加入浓度为1mol/LNaCl溶液覆盖15min倒掉，产纤维素酶的菌落周围会出现透明圈。
挑取较大透明圈的菌落接种在试管斜面上纯化，反复验证纯化直到只存在单菌落纤维素降解菌为止，将获得的纯种在斜面培养基中短期保存。
1.2.7环境因素对微生物的影响
影响微生物生长的外界因素很多，其一是化学因素，其二是物理因素、其次是生物和营养因素。
当环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；
当环境条件的变化超过一定极限时，则导致微生物的死亡。
本次试验研究氧气对微生物的影响。
各种微生物对氧的需求不同，反映出不同种类微生物细胞内生物氧化酶系统的差别。
采用深层穷执法测定氧对不同类型微生物生长的影响情况，根据微生物在使馆中的生长部位，判断各类微生物对氧的需求及耐受能力
（1）在菌种的斜面培养物上加入2ml无菌生理盐水，制成菌悬液。
（2）将灭菌后的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基倒入试管中约1/2，待冷却到45-50℃时加入菌悬液1ml，快速搓动试管，待军中均匀分布于培养基后，将试管置于冰浴中迅速凝固。
（3）将试管置于28℃温箱中，48h观察结果，记录各菌在深层培养基内的生长状况。
1.2.8基因组DNA提取
1、细菌培养：
将纯化的纤维素分解菌接种于液体培养基中，37℃摇床（160rpm）培养过液。
2、细菌收集：
取1ml培养物于1.5mlEP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mlddH2O。
3、菌体裂解：
加入6μl溶菌酶，37℃超声15min。
后依次加入NaCl50μl，SDS110μl，PK3μl，50℃超声15min（此时菌液应为透明粘稠液体）
4、抽提：
菌液均分到两个1.5mlEP管，加等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀，室温放置5-10min。
12000rpm离心5min，取上清加入新的离心管中。
抽提两次。
（上清很粘稠，吸取时应小心）
5、沉淀：
加0.6倍体积的异丙醇，轻柔混匀，室温放置10min。
12000rpm离心10min。
6、洗涤：
沉淀加500ul75%的乙醇洗涤。
7、抽（凉）干后，溶于50μlddH2O中，加入2ulRNase，取2-5μl电泳。
作PCR模板用
1.2.9琼脂糖凝胶电泳
1、配胶：
0.6g琼脂糖，60ml1×
TAE，摇匀，微波炉加热溶解（小心沸腾）。
2、冷却至50℃加入染料10ul，顺时针摇匀后的凝胶倒入制胶室，插入梳子，室温冷却凝固（小心气泡）
3、将凝胶置入电泳槽中，加1×
TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子
4、用移液器吸取总DNA4μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔
如下图所示：
5、打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min
6、电泳结束后取出凝胶，置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条
7、DNA样品做好标记，4℃保存，作为下次实验的模板。
1.2.10PCR扩增
以提取好的纤维素分解菌基因组DNA为模板，设计引物2F/2R，3F/3R，4F/4R，在酶反应缓冲液Buffer中，以dNTP，为原料，在Taq聚合酶催化下进行PCR扩增。
1、取4个PCR管，每管中加入模板2ul，至于冰上；
2、再取1个PCR管，加入以下物质，充分混匀：
引物F5ul，引物R5ul，Buffer12.5ul，dNTP10ul，最后加Taq聚合酶2.5ul
3、混匀后，分别取混合液7ul加入前4个PCR管中，每个管中再加入11ul水，混匀，放入PCR仪中。
4、PCR扩增
94℃预变性5min后进入循环，变性94℃1min、退火55℃90s、延伸72℃2min。
大约30个循环后72℃体系稳定5min。
5、4℃保存
6、向扩增产物中加入上样缓冲液，以浓度为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.11从凝胶中分离回收DNA的方法
PCR反应获得的目的片段、酶切后所得特定的DNA序列、分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其他的DNA分开，这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的DNA，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。
回收DNA的方法有：
电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法、试剂盒。
本次试验用OMEGA琼脂糖凝胶回收试剂盒。
1，取一个新的HibindDNA结合柱装在收集管中，吸取200ulBufferGPS平衡缓冲液，室温放置3-5min
2，12000rpm离心2min，倒弃收集管中的滤液，将HibindDNA结合柱重新装在收集管中；
3，加入700ulddH2O至柱子中
4，12000rpm离心2min，倒弃收集管中的滤液，将HibindDNA结合柱重新装在收集管中；
5，在紫外灯下，将含目标DNA片段的琼脂糖凝胶条带切下（尽量切去多余的凝胶），放入1.5ml离心管中；
6，加入4倍体积的BB，50℃水浴5min，震荡混匀至凝胶完全溶解；
7，将样品转移到一个HiBindDNA离心柱（<
750ul），并装进一个干净的2ml收集管里，10,000rpm离心1min，弃去流出液；
8，加入750ul的已用无水乙醇稀释过的SPW洗涤柱子，10,000rpm离心1min，弃去流出液，重复此步骤一次；
9，10,000rpm离心空柱1min，甩干柱基质；
10，把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，将30ul灭菌ddH2O直接加到柱基质上，10,000rpm离心1min以洗脱DNA。
11，4℃保存，下次与载体连接转化。
1.2.12重组子的构建、转化与筛选
1、向PCR管中依次加入以下试剂：
pBlueFree-TVector1ul
PCR纯化产物5ul
灭菌ddH2O2ul
用移液器吹打混匀
然后加5×
LigationSolution2ul
•上述溶液混合后，短暂离心至管底，16℃连接30min
2、每管感受态细胞加入5ul连接产物，同时做一个空白对照
3、轻轻混匀，立即放在冰上30min；
4、42℃水浴90s，然后迅速冰浴2min；
5、加入37℃预热的LB液体培养基600ul，200rpm，37℃震荡60min；
6、取培养液100ul，涂布于含有Amp100ug/ml的平板上，至液体被培养基全部吸收。
7、平板倒置，37℃，过夜
1.2.13重组型纤维素分解菌株的验证
按纤维素分解菌的筛选方法对重组型纤维素分解菌进行验证、分离、鉴定、纯化，得到纯种高效的分解纤维素的重组型菌种，保存菌株以后备用。
2实验结果
1，在没有染杂菌的前提下，选择培养基上菌落的白色圆形，通过对菌株固体观察发现，其菌丝体为白色絮状，菌落直径大约为12mm。
2，菌种的分类鉴定实验中，本实验土样中获取的目的菌种革兰氏染色鉴定为阳性，芽孢染色显示有大量芽孢。
霉菌染色比较模糊，有霉菌的颜色反应。
初步鉴定属木霉。
3、微生物大小测定中，目的菌种大小约为3.4μm
4、菌落纯化过程中，刚果红染色后出现较大的透明圈，透明圈越大表示该菌种分解纤维素活力越强。
5、环境因素对微生物的影响中，接种在试管的菌种都生活在培养基的中上层，说明此次分离的菌种为好氧菌。
6、基因组DNA提取风干后有白色沉淀收集物，说明提取出了DNA
7、提取DNA后的电泳
电泳条带比较整齐，说明提取的DNA比较完整，没被分解破坏。
8、PCR扩增后电泳图
Maker（左）实验DNA扩增电泳（右）
9、无染菌前提下重组菌种能在选择培养基上生存并出现菌落说明重组实验成功
4讨论
1、实验材料的影响
实验选样应该选有落叶等纤维素较多的土样。
培养基选择不当也会对实验结果造成很大影响，在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，培养基的种类很多。
所以对于不同微生物应该选择不同的培养基，相应的碳源、氮源等营养物质，以及pH等都应与所培养的菌种相对应。
2、透明圈直径能够直接反映该菌产纤维素酶的能力,刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂,染色之后能和纤维素结合形成红色水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。
根据透明圈的大小可直接分离出搞笑高活性的菌株。
3、革兰氏染色注意事项
每部都要按规定进行操作，尤其注意酒精脱色的时间，不可过长也不可过短，脱色时间过长可能出现假阴性结果；
脱色时间过长，可能出现假阳性结果。
4、影响微生物生长的外界因素很多，其一是化学因素（包括各种化学抑菌剂和杀菌剂），其二是物理因素（温度，渗透压，PH，紫外线，氧气等）、其次是生物和营养因素。
本次实验研究的是氧气对微生物生长的影响。
5、纤维素分解菌总DNA提取是在碱性条件下，用表面活性剂SDS将细菌细胞壁破裂，然后用高浓度的NaCl沉淀蛋白质等杂质，经过氯仿抽提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯的总DNA。
6、根据产纤维素酶基因合理的设计引物，用PCR技术扩增大量的DNA片段，可以达到大量扩增目的基因的目的。
7、在试验中，PCR反应获得的目的片段经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其他的DNA分开，然后将目的DNA从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的DNA，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。
8、重组子的筛选方法常用的有两种方法：
抗生素筛选法和互补法。
互补法最常用的是x-gal蓝白筛选。
本实验采用的是抗生素筛选法。
5结论
本实验选取的土样，经适当的培养基进行筛选、分离纯化，得到了分解纤维素的单菌落。
经过对这株菌进行形态学鉴定、生理生态学鉴定，对这株菌有初步的了解。
进一步通过分子生物学的技术手段提取产纤维素酶的基因进行PCR扩增、DNA转化转染，整合到受体菌株上，从而大体上得到了能分解纤维素的重组型菌种。
本次实验室验证性实验，在老师的指导下，通过小组合作和查阅文献，掌握了一些纤维素分解菌的筛选与研究的相关技术，懂得了无菌操作对整个实验过程的重要性，初步窥探了分子生物学实验操作的严谨与认真。
我相信，作为学生的我们在前人的基础上反复的做验证性实验，总有一天会有更加伟大的创造性实验的。
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