纤维素分解菌的筛选和研究论文附件Word下载.docx

1、1.1实验材料与器材 21.1.1实验样品 21.1.2实验试剂 21.1.3实验仪器 31.2研究方法 41.2.1培养基的配制 41.2.2样品的采集 51.2.3菌株的分离与筛选 51.2.4 形态学鉴定 51.2.5 微生物大小的测定 61.2.6 菌种纯化 61.2.7环境因素对微生物的影响 71.2.8 基因组DNA提取 71.2.9琼脂糖凝胶电泳 71.2.10 PCR扩增 81.2.11 从凝胶中分离回收DNA的方法 81.2.12重组子的构建、转化 与筛选 91.2.13重组型纤维素分解菌株的验证 102 实验结果 104讨论 115结论 12参考文献 13引 言纤维素是自然

2、界中存在的最廉价、最丰富的天然可再生资源,存在许多高能氢键, 因此其水解、利用较困难,利用微生物分解纤维素能够节省资源又减少对环境造成的污染。纤维素是碳源营养物质，已知的分解纤维素的真菌有野生型的曲霉、青霉、木霉等，细菌有纤维素单胞菌、纤维弧菌，在有氧条件下起分解纤维素作用的主要是真菌，可利用这些特点设计筛选方案。天然纤维素原料是地球上最丰富的可再生有机物质。全世界通过光合作用产生的植物物质每年高达2000亿t，目前有89未被人类利用，只有11用作饲草、造纸和建筑原料。绝大部分的天然纤维素原料在自然环境中被各种微生物分解转化，最终形成CO2和H2O。虽然这是生态系统中碳循环的一个重要环节，但从

3、人类利用自然资源的角度看，无疑是巨大的浪费。在我国，大部分秸秆和树林副产品被用作燃料或在田间被直接烧掉，不但破坏了生态平衡，污染环境，还存在火灾隐患。发展和利用生物技术分解转化天然纤维素原料既是资源利用的有效途径，而且对于解决环境污染、粮食短缺和能源危机也具有重大的现实意义。纤维素分解菌分为降解纤维素细菌、降解纤维素放线菌、降解纤维素真菌。生物降解纤维素研究进程中有待解决的问题：目前用于生产纤维素酶的菌株多为木霉、青霉和曲霉等，普遍存在酶活力较低的问题。筛选高效纤维素分解菌是利用秸秆纤维素的关键。纤维素酶价格贵，利用成本高，要使纤维素酶真正能够应用于生产，必须设法降低纤维素酶的成本，如筛选新菌

4、株，改善生产工艺等。酶产量及酶的比活力低一直是影响纤维素酶实际应用的重要原因。目前，纤维素酶形成的机制和原理还未完全搞清楚。因此通过实验研究确定最适产酶条件具有重要意义。通过分子生物学的技术手段提取产纤维素酶的基因进行PCR扩增、DNA转化转染，整合到受体菌株上，从而得到能分解纤维素的重组型菌种，为生物降解纤维素研究做贡献。1 材料与实验方法1.1实验材料与器材1.1.1实验样品本实验的样本材料取自大庆师范学院生命科学学院实验楼门前花圃土壤。1.1.2实验试剂表1 主要使用试剂试剂名称产地NaCl天津市巴斯夫化工有限公司95%酒精天津市富宇精细化工有限公司牛肉膏北京奥博星生物技术有限责任公司酵

5、母粉北京市海淀区微生物培养基制品厂琼脂福建泉州市泉港化工厂生理盐水蛋白胨天津市天力化学试剂有限公司甲基红上海化学试剂采购供应站HCl氢氧化钠锦州古城化学试剂厂孔雀绿番红染液KNO3K2HPO43H2OMgSO47H2OKH2PO4Taq聚合酶溶菌酶Buffer GPS平衡缓冲液BBTAE电泳缓冲液pBlueFree-T TA克隆载体DH5感受态细胞LB液体氨苄青霉素Amp氯仿异戊醇异丙醇1.1.3实验仪器表2 主要仪器设备名称型号目镜测微尺镜台测微尺电子天平广州市正一科技公司FA2004N超净工作台哈东联电子技术开发有限公司BNQ-1360生物显微镜麦克奥迪SFC288全温振荡培养箱HZQ-F

6、160恒温培养箱高压灭菌锅TOMY KOGYO CO.LTDES-315微波炉格兰仕微波炉电器有限公司WD800GPCR扩增仪离心机电泳仪移液枪EP管紫外透射检测仪SPW洗涤柱子水浴锅冰箱紫外分光光度计Hibind DNA结合柱离心柱注：三角瓶，镊子，试管，平板，烧杯，PH试纸等基本仪器略，需要灭菌的仪器高压蒸汽灭菌，121 20min1.2研究方法在校园里取落叶等纤维素含量丰富的土样品，采用稀释法和平板三区划线在选择培养基上挑取单菌落，并进行细菌的分离和纯化。对分离出的菌种进行简单的革兰氏染色、芽孢染色、霉菌染色及大小测定初步对其进行分类鉴定。实验改变条件研究了解化学因素、物理因素、生物因素

7、对微生物生长的影响有助于跟好的培养纤维素分解菌。利用分子生物学的技术手段提取产纤维素酶的基因进行PCR扩增，电泳检测后回收目的基因，把目的基因与载体连接并整合到受体菌株上，从而得到能分解纤维素的重组型菌种。1.2.1培养基的配制（1）选择培养基表3 选择培养基纤维素5g酵母膏0.5g水解酪素NaNO30.51g0.9g蒸馏水KClNa2HPO4.7H2O1000ml1.2gMgSO4.7H2O（2）葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基表4 葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基葡萄糖10g3g20gpH7.0-7.2 注：培养基高压蒸汽灭菌，121 20min1.2.2样品的采集在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离

8、地面5-15cm处的土约5g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。1.2.3菌株的分离与筛选称取土样样品约5g，加入到一个盛有30 mL 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，将样品充分打散混合混均10min，静止取上清，消毒步骤后，用接种环接种在选择平板培养基上，三区画线，封口，写好相应编号，倒置于28恒温培养箱中培养3-5天，长出菌落可初步鉴定为能降解纤维素的菌。 1.2.4 形态学鉴定1、革兰氏染色（1）制片，取活跃生长期的菌种进行涂片、干燥和固定。（2）初染，滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色12min后倾去染液，水洗至流出水无色。（3）媒染

9、，先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。（4）脱色，将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色，当流出液无色时立即用水洗去乙醇。（5）复染，将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。油镜观察 。2、芽孢染色制片-干燥-固定-染色（孔雀绿加热5min）-水洗-复染（番红染液2min）-水洗-镜检3、霉菌染色观察在载玻片上加一滴美蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观

10、察，必要时换高倍镜观察。挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。1.2.5 微生物大小的测定1、校正目镜测微尺1）放镜台测微尺2）校正：对准焦距转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。3）计算：因为镜台测微尺的刻度每格长l0m，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度目镜测微尺每格长度（ m）=（镜台测微尺格数10）/目镜测微尺格数 2、菌体大小的测定校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌标本片，低倍镜下找到标本后，换油镜测定球菌的直径和杆菌的长和宽。

11、测定时，测出细菌直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将所得的格数乘以每个代表的长度，即为该菌大小。一般测3-5个菌。3、测定完毕，整理。1.2.6 菌种纯化采用三区划线法进行分离，在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/ml的刚果红溶液，10-15min倒去，加入浓度为1mol/LNaCl溶液覆盖15min倒掉，产纤维素酶的菌落周围会出现透明圈。挑取较大透明圈的菌落接种在试管斜面上纯化，反复验证纯化 直到只存在单菌落纤维素降解菌为止，将获得的纯种在斜面培养基中短期保存。1.2.7环境因素对微生物的影响影响微生物生长的外界因素很多，其一是化学因素，其二是物理因素、其次是生物和营养因素。当环

12、境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；当环境条件的变化超过一定极限时，则导致微生物的死亡。本次试验研究氧气对微生物的影响。各种微生物对氧的需求不同，反映出不同种类微生物细胞内生物氧化酶系统的差别。采用深层穷执法测定氧对不同类型微生物生长的影响情况，根据微生物在使馆中的生长部位，判断各类微生物对氧的需求及耐受能力（1）在菌种的斜面培养物上加入2ml无菌生理盐水，制成菌悬液。（2）将灭菌后的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基倒入试管中约1/2，待冷却到45-50时加入菌悬液1ml，快速搓动试管，待军中均匀分布于培养基后，将试管置于冰浴中迅速凝固。（3）将试管置于28温箱

13、中，48h观察结果，记录各菌在深层培养基内的生长状况。1.2.8 基因组DNA提取1、细菌培养：将纯化的纤维素分解菌接种于液体培养基中，37摇床（160rpm）培养过液。2、细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml ddH2O。3、菌体裂解：加入6l 溶菌酶，37超声15min。后依次加入NaCl 50l，SDS 110l，PK 3l，50超声15min（此时菌液应为透明粘稠液体）4、抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的氯仿异戊醇（241），颠倒混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心5min，取上清加

14、入新的离心管中。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心）5、沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，轻柔混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6、洗涤：沉淀加500ul 75%的乙醇洗涤。7、抽（凉）干后，溶于50l ddH2O中，加入2ul RNase，取2-5l电泳。作PCR模板用1.2.9琼脂糖凝胶电泳1、配胶：0.6g 琼脂糖，60ml 1TAE，摇匀，微波炉加热溶解（小心沸腾）。2、 冷却至50加入染料10ul，顺时针摇匀后的凝胶倒入制胶室，插入梳子，室温冷却凝固（小心气泡）3、 将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子4、 用

15、移液器吸取总DNA 4l于封口膜上，再加入2l 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔如下图所示：5、打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min6、电泳结束后取出凝胶，置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条7、DNA样品做好标记，4保存，作为下次实验的模板。1.2.10 PCR扩增以提取好的纤维素分解菌基因组DNA为模板，设计引物2F/2R，3F/3R，4F/4R，在酶反应缓冲液Buffer中，以dNTP，为原料，在Taq聚合酶催化下进行PCR扩增。1、取4个PCR管，每管中加入模板2ul，至于冰

16、上；2、再取1个PCR管，加入以下物质，充分混匀：引物F5ul，引物R 5ul，Buffer12.5ul，dNTP10ul，最后加Taq聚合酶2.5ul3、 混匀后，分别取混合液7ul加入前4个PCR管中，每个管中再加入11ul水，混匀，放入PCR仪中。4、 PCR扩增94 预变性5min后进入循环，变性 941min、退火5590s、延伸722min。大约30个循环后72体系稳定5min。5、 4 保存6、 向扩增产物中加入上样缓冲液，以浓度为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.11 从凝胶中分离回收DNA的方法PCR反应获得的目的片段、酶切后所得特定的DNA序列、分子杂交中所制备的探针等

17、，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其他的DNA分开，这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的DNA，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。回收DNA的方法有：电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法、试剂盒。本次试验用OMEGA琼脂糖凝胶回收试剂盒。1，取一个新的Hibind DNA结合柱装在收集管中，吸取200ulBuffer GPS平衡缓冲液，室温放置3-5min2，12000rpm离心2min，倒弃收集管中的滤液，将Hibind DNA结合柱重新装在收集管中；3，加入700ul ddH2O至柱子中4，12000rpm离心2min，倒弃收集管中

18、的滤液，将Hibind DNA结合柱重新装在收集管中；5，在紫外灯下，将含目标DNA片段的琼脂糖凝胶条带切下（尽量切去多余的凝胶），放入1.5ml离心管中；6， 加入4倍体积的BB，50水浴5min，震荡混匀至凝胶完全溶解；7，将样品转移到一个HiBind DNA离心柱（750ul），并装进一个干净的2ml收集管里，10,000rpm离心1min，弃去流出液；8，加入750ul的已用无水乙醇稀释过的SPW洗涤柱子，10,000rpm离心1min，弃去流出液，重复此步骤一次；9，10,000rpm离心空柱1min，甩干柱基质；10，把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，将30ul灭菌ddH2O

19、直接加到柱基质上，10,000rpm离心1min以洗脱DNA。11， 4保存，下次与载体连接转化。1.2.12重组子的构建、转化 与筛选 1、向PCR管中依次加入以下试剂：pBlueFree-T Vector 1ulPCR纯化产物 5ul灭菌ddH2O 2ul用移液器吹打混匀然后加5Ligation Solution 2ul 上述溶液混合后，短暂离心至管底，16连接30min2、每管感受态细胞加入5ul连接产物，同时做一个空白对照3、轻轻混匀，立即放在冰上30min；4、42水浴90s，然后迅速冰浴2min；5、加入37预热的 LB液体培养基600ul，200rpm，37 震荡60min；6、

20、取培养液100ul，涂布于含有Amp100ug/ml的平板上，至液体被培养基全部吸收。7、平板倒置，37 ，过夜1.2.13重组型纤维素分解菌株的验证按纤维素分解菌的筛选方法对重组型纤维素分解菌进行验证、分离、鉴定、纯化，得到纯种高效的分解纤维素的重组型菌种，保存菌株以后备用。2 实验结果1，在没有染杂菌的前提下，选择培养基上菌落的白色圆形，通过对菌株固体观察发现，其菌丝体为白色絮状，菌落直径大约为12 mm。2，菌种的分类鉴定实验中，本实验土样中获取的目的菌种革兰氏染色鉴定为阳性，芽孢染色显示有大量芽孢。霉菌染色比较模糊，有霉菌的颜色反应。初步鉴定属木霉。3、微生物大小测定中，目的菌种大小约

21、为3.4m4、菌落纯化过程中，刚果红染色后出现较大的透明圈，透明圈越大表示该菌种分解纤维素活力越强。5、环境因素对微生物的影响中，接种在试管的菌种都生活在培养基的中上层，说明此次分离的菌种为好氧菌。6、基因组DNA提取 风干后有白色沉淀收集物，说明提取出了DNA7、提取DNA后的电泳电泳条带比较整齐，说明提取的DNA比较完整，没被分解破坏。8、PCR扩增后电泳图Maker（左） 实验DNA扩增电泳（右）9、无染菌前提下 重组菌种能在选择培养基上生存并出现菌落 说明重组实验成功4讨论1、实验材料的影响实验选样应该选有落叶等纤维素较多的土样。培养基选择不当也会对实验结果造成很大影响，在自然界中，微

22、生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，培养基的种类很多。所以对于不同微生物应该选择不同的培养基，相应的碳源、氮源等营养物质，以及pH等都应与所培养的菌种相对应。2、透明圈直径能够直接反映该菌产纤维素酶的能力,刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂,染色之后能和纤维素结合形成红色水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。根据透明圈的大小可直接分离出搞笑高活性的菌株。3、革兰氏染色注意事项每部都要按规定进行操作，尤其注意酒精脱色的时间，不可过长也不可过短，脱色时间过长可能出现假阴性结果；脱色时间过长，可能出现假阳性结果。4、影响微生物生长的外界因素很多，其一是化学因素（包括各种

23、化学抑菌剂和杀菌剂），其二是物理因素（温度，渗透压，PH，紫外线，氧气等）、其次是生物和营养因素。 本次实验研究的是氧气对微生物生长的影响。5、纤维素分解菌总DNA提取是在碱性条件下，用表面活性剂SDS将细菌细胞壁破裂，然后用高浓度的NaCl沉淀蛋白质等杂质，经过氯仿抽提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯的总DNA。6、 根据产纤维素酶基因合理的设计引物，用PCR技术扩增大量的DNA片段，可以达到大量扩增目的基因的目的。7、 在试验中，PCR反应获得的目的片段经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其他的DNA分开，然后将目的DNA从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的DNA，以用于以后

24、分子杂交，重组子构建，序列分析等。8、 重组子的筛选方法常用的有两种方法：抗生素筛选法和互补法。互补法最常用的是x-gal蓝白筛选。本实验采用的是抗生素筛选法。5结论本实验选取的土样，经适当的培养基进行筛选、分离纯化，得到了分解纤维素的单菌落。经过对这株菌进行形态学鉴定、生理生态学鉴定，对这株菌有初步的了解。进一步通过分子生物学的技术手段提取产纤维素酶的基因进行PCR扩增、DNA转化转染，整合到受体菌株上，从而大体上得到了能分解纤维素的重组型菌种。本次实验室验证性实验，在老师的指导下，通过小组合作和查阅文献，掌握了一些纤维素分解菌的筛选与研究的相关技术，懂得了无菌操作对整个实验过程的重要性，初

25、步窥探了分子生物学实验操作的严谨与认真。我相信，作为学生的我们在前人的基础上反复的做验证性实验，总有一天会有更加伟大的创造性实验的。参考文献1沈雪亮, 夏黎明. 产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性研究 J . 林产化学与工业, 2002, 22（ 1 ）: 47- 51.2魏桃员, 张素琴, 邵林广, 等. 一株纤维素降解细菌的分离及特性研究 J . 环境科学与技术, 2004, 27 （ 5） : 1- 2, 39.3蔡宝立, 黄今勇. 除草剂阿特拉津生物降解研究进展 J. 生物工程进展, 1999, 19 （ 3） : 7- 11. 4 刘春芬, 贺稚非, 蒲海燕, 等. 纤维素酶及应用现状 J . 粮食与油脂, 2004, （ 1） : 15-1.5 魏亚琴, 李永泉, 李红玉. 分解纤维素的三株真菌的筛选与鉴定 J . 兰州大学学报, 2008, 44（ S1） : 92-96.