微生物实验指导Word文档下载推荐.docx

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3、将光圈调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反放向旋转），当视野中出现物象时，改用细调节器调节到物象清楚为止。

如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物象，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物象看清为止。

仔细观察并绘图。

4、再次观察提起镜筒，换上放线菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。

重复观察时可比第一次少加香柏油。

（五）镜检完毕后的工作

1、提起镜筒，或降下载物台

2、移开物镜镜头

3、取出装片

4、清洁油镜油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。

5、擦净显微镜，将各部分还原。

将物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。

最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。

四、注意事项

1、使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察的程序操作。

2、下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。

3、使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。

4、注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。

五、演示

如何使用油镜观察染色装片的要点，如滴油、下降镜头、调焦、擦拭镜头等

六、实验报告

分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率

七、问题和思考

1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？

应特别注意些什么？

2、使用油镜时，为什么必须用镜头油？

3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？

实验二细菌形态的观察

巩固油镜的使用；

掌握细菌形态观察的基本方法，了解细菌的基本形态

1、观察细菌的基本形态染色装片

2、观察枯草芽孢杆菌活菌

3、观察细菌细胞结构的染色装片

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌；

变形菌装片

（一）、观察细菌的基本形态

用低倍镜、高倍镜和油镜观察大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、变形菌的染色装片，并分别在油镜下绘图

（二）、观察枯草杆菌活菌

常用压滴法：

1、将洁净无油腻的载片放于自己正前方，在中央放一滴无菌水

2、将酒精灯放于自己正前方，点燃

3、用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的随地充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架

4、用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。

如菌液过多，可用吸水纸吸去一部分。

5、先用低倍镜然后转用高倍镜观察，观察时光线要适当调暗一些。

1、注意擦镜头时，只能用擦镜纸

2、观察完毕，必须将镜筒上升，才能取下装片，放入另一装片后，要按使用油镜要求，重新操作，不能在油镜下直接取下和替换装片

3、无菌操作过程中，接种环美军后不能触及其他物品，挑菌不能过多

1、细菌细胞结构装片示范镜

2、无菌操作过程

3．怎样盖盖玻片才不产生气泡。

（一）绘图

1．绘出你所观察到的几种细菌的个体形态视野图

2．绘出你所观察到的细菌细胞结构视野图，并注明各部分

（二）试指出在制备活菌装片时，应注意什么问题?

七、问题与思考

1．用明视野显微镜观察细菌的形态时，你认为用染色装片好，还是用非染色的活体装片好，为什么?

观察活体装片与染色装片，光线调节各有什么不同?

2．无菌操作过程中，可否将棉塞放在桌面上?

为什么?

实验三细菌简单染色法及口腔微生物的观察

一、试验目的和实验内容

巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术，了解口腔中的微生物及其观

察方法。

1、细菌单染色操作技术

2、染色法或负染色法观察口腔中的微生物

大肠杆菌（E．coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的斜面菌种。

吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。

（一）单染色法

1、涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1—1．5Cm2（图7—1A、B）。

2、干燥将涂片于室温中自然干燥

3、固定手执载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。

在火上固定，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。

不能将载片—在火上烤，否则细菌形态毁坏（图7—1C）。

4、染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2rain（图7—1D

5、水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图7—1E）。

6、干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体（图7—1F）。

7、待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用拍

图7—1负染色的推片方法

（二）口腔微生物的观察

1、单染色法

（1）在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，涂成薄膜。

（2）将涂片于室温中自然干燥后，按上面单染色法的步骤，进行固定、染色、水洗，干燥后镜检。

2．负染色法

（1）在洁净无油腻的载片的一端滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，然后加少许黑色素溶液，充分混匀。

（2）另取一载片将其边缘放在含菌载片的一端，然后推向另一端，则含菌载片上的混合液被推成薄膜。

（3）于室温中自然干燥。

（4）镜检：

将光线调亮，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。

载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。

涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄

1．单染色的主要步骤。

；

2．负染色的推片方法。

1、单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图

2、你所观察到的口腔微生物的形态图，并注明使用的染色方法，菌体和背景的颜色

3、你所观察到的口腔微生物的形态图，并注明使用的染色方法，菌体和背景的颜色。

（二）单染色法和负染色法操作要点。

1．涂片在染色前为什么要先进行固定?

固定时应注意什么问题?

2．制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?

制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察?

3．你知道口腔中通常存在哪些微生物吗?

如何进行区分?

实验四细菌的革兰氏染色

一、实验目的和内容

初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤

1．制作细菌染色装片。

2．进行革兰氏染色法操作

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大肠杆菌（E．coli）菌液，待测菌菌液1～2种。

革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等）、香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、试管、小滴管

三、操作步骤

（一）制片

1．涂菌用无菌操作方法从试管中沽取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。

涂菌后将接种环火焰灭菌

2．干燥于空气中自然干燥。

亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。

3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。

此制片可用于染色。

（二）染色

1．初染于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。

2．媒染滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。

3．脱色滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止（根据涂片之厚度需时30s至lmin），水洗。

4．复染滴加番红（石炭酸复红）液复染1min，水洗。

5．用滤纸吸干，油镜镜检。

（三）结果

革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。

（四）检测未知菌

用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。

1．涂片务求均匀，切忌过厚。

2．在染色过程中，不可使染液干涸。

3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌。

4．老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。

制片方法及染色过程。

（一）绘图

1．大肠杆菌革兰氏染色视野图。

2．金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图。

（二）记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。

（三）未知菌的检测结果。

1．涂片后为什么要进行固定?

固定时应注意什么?

2．什么是革兰氏染色法?

染色过程应注意什么?

3．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。

实验五细菌的芽胞染色

一、实验目的：

学习细菌的芽胞染色法

二、实验原理：

细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。

芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。

所有的芽胞染色法都基于同一个原则：

除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。

当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。

然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。

三、实验材料

1.活材料：

培养36小时的苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillussubtilis）。

2.染色液和试剂：

5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液[见附录二

（一）6、5]。

3.器材：

小试管（75mm×

10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。

四、实验方法

1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法

（1）制备菌液：

加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。

（2）加染色液：

加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

（3）加热：

将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15—20min。

（4）涂片：

用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。

（5）固定：

将涂片通过酒精灯火焰3次。

（6）脱色：

用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

（7）复染：

加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。

（8）镜检：

先低倍，再高倍，最后用油镜观察。

结果：

芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。

2.Schaeffer与Fulton氏染色法

（1）涂片：

按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。

（2）晾干固定：

待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。

（3）染色：

①加染色液：

加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持15-20min。

加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。

（加热时温度不能太高）。

②水洗：

待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。

③复染：

用蕃红液染色5min。

（4）水洗、晾干或吸干。

（5）镜检：

先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。

。

芽胞呈绿色，菌体为红色。

五、实验作业：

绘出所用材料的芽胞和菌体的形态图。

六、注意事项

1.供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。

2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。

3.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。

实验六酵母菌的形态观察实验

一、实验目的和内容：

了解自然存在的酵母菌及其形态结构。

了解酵母菌产生子囊孢子的条件及其形态

1．观察酵母菌个体形态。

2．观察酵母菌的假菌丝和繁殖过程。

3．观察自然状态的酵母菌。

酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、热带假丝酵母（Candidatropicalis）斜面菌种。

PDA培养基、麦氏（McCLary）培养基（醋酸钠培养基）、0．05％美蓝染色液（以pH6．0的0．02mol／L磷酸缓冲液配制）、碘液、0．04％的中性红染色液、5％孔雀绿，0．5％沙黄液、95％乙醇。

显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、V形玻璃棒、放置一个三角形玻璃棒支架的培养皿。

三、操作步骤

（一）酵母菌形态观察

1．酵母菌的活体染色观察及死亡率的测定

（1）以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。

（2）取0．05％美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞（蓝色）与活细胞（不着色）。

（3）在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5—6个视野。

酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算：

死亡率=死细胞总数/死活细胞总数（%）

2．酵母菌液泡系的活体观察于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混合，染色5min，加盖玻片在显微镜下观察。

细胞无色，液泡呈红色。

3．酵母菌细胞中肝糖粒的观察将1滴碘液置于载玻片中央，接入上述酵母菌悬液，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。

4．酵母菌子囊孢子的观察

（1）活化酿酒酵母：

将酿酒酵母接种至新鲜的PDA培养基上，置28‘C培养2～3d，然后再移植2～3次。

（2）移接产孢培养基：

将活化的酿洒酵母移接至醋酸钠培养基上，置30C恒温培养14d。

（3）观察：

挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，lmin后水洗，加95％乙醇30s，水洗，最后用o．5％沙黄液复染30s，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干。

制片干燥后，镜检，子囊孢子呈绿色，子囊为粉红色。

注意观察子囊孢子的数目、形状和子囊的形成率。

（4）计算子囊形成的百分率：

计数时随机取3个视野，分别计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞，然后按下列公式计算：

子囊形成率（％）＝三个视野中形成子囊的总数/三个视野中（形成子囊的总数加不产豹子细胞总数）XlOO％

5．酵母菌假菌丝的观察取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中，取出放在湿室培养的支架上，待培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上（图13—1），28℃培养2～3d后，取出载玻片，擦去载玻片下面的培养基，在显微镜下直接观察。

可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝（图13—2）。

i

6．自然状态下的酵母菌观察取一滴美蓝染色液于载玻片中央，春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜汤上的白膜，将其置于载玻片染色液中，盖上盖玻片，显微镜下仔细观察酵母菌形态，出芽生殖，假菌丝等。

图13—1酵母菌假菌丝的培养图13—2酵母菌的假菌丝形态

B．藕节状假菌丝；

B．竹节状假菌丝

1、用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润。

2、在产孢培养基上加大移种量，可提高子囊形成率。

3、通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。

1．酵母菌子囊及子囊孢子，酵母菌假菌丝的示范镜。

2．假菌丝培养的操作过程。

1．数个酵母菌细胞，示观察到的结构。

2．数个子囊及子囊孢子形态图。

（二）记录并计数酵母菌的死亡率及子囊形成率（原始记录及计算结果）。

七、问题和思考’

1．酵母菌的假菌丝是怎样形成的?

与霉菌的真菌丝有何区别?

2．如何区别营养细胞和释放出的子囊孢子?

3．试设计一个从子囊中分离子囊孢子的试验方案。

注：

酵母菌的简易培养配2％葡萄糖水（或白糖水），煮沸，装入三角瓶中（液面高度2~3cm），加HCl调至pH3—4，放人几块葡萄皮（或其他糖分较高的果皮），置25—28℃温箱中培养2-3d，闻到酒香味后，即可取培养液镜检。

实验七霉菌的形态观察

一、实验目的和内容

了解霉菌形态，掌握微生物载玻片湿室培养方法。

1．霉菌载玻片湿室培养。

2．曲霉、青霉、根霉、毛霉形态观察。

3．根霉假根的观察。

产黄青霉、黑曲霉、黑根霉、总状毛霉等斜面菌种。

半固体PDA培养基、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20％甘油。

透明胶带、剪刀、培养皿、门形玻棒搁架、盖玻片、圆形滤纸片、细口滴管、镊子、显微镜、接种环、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、吸水纸等

（一）霉菌的载玻片湿室培养

可4人合作，每人制作一霉菌的载玻片。

1．准备湿室在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一“门”形载玻片搁架，在搁架上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎，经121℃湿热灭菌30min后，置60℃烘箱中烘干，备用。

2．取菌接种用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。

接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可（务必记住接种的位置）。

3．加培养基用无菌细口滴管吸取少量融化约60℃的培养基，滴加到载玻片的接种处，培养基应滴得圆而薄，其直径约为0．5cm（滴加量一般以1／Q小滴为宜）。

4。

加盖玻片在培养基未彻底凝固前，用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上、用镊子轻压，使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁，否则不透气。

5．倒保湿剂每皿倒人约3mL20％的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润湿，以保持皿内湿度。

皿盖上注明菌名、组别和接种日期。

此为制成的载玻片湿室，置28C恒温培养3～5de

（二）黑根霉假根的培养

将融化的PDA培养基，冷却至50C倒入无菌平皿，其量约为平皿高度的1超。

冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在乎板表面划线接种。

然后将平皿倒置，在皿盖内放一无菌载玻片，于28℃培养2—3d后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构（图14—1）。

（三）镜检观察

1．湿室培养霉菌镜检载玻片从培养16—20h开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。

将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。

绘图。

2．粘片观察取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。

镜检。

3．假根观察将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。

只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。

4．制成永久装片把观察到霉菌形态较清晰，完整的片子，制成标本作较长期保存。

制备方法是，轻轻揭去盖玻片，如果载玻片上有琼脂，仔细挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，盖上清洁盖玻片，在盖玻片四周滴加树胶封固。

载玻片湿室培养时，盖玻片不能紧贴载玻片，要彼此有极小缝隙，一是为了通气；

二是使各部分

结构平行排列，易于观察。

1．4种霉菌制片的示范。

2．载玻片湿室培养方法。

（一）绘制镜检形态图

1、毛霉和根霉形态图，示各部

2、青霉和曲霉形态图，示各部

（二）载玻片观察纪录

各菌种的载玻片标本观察结果

菌种

菌丝体

（气生菌丝、营养菌丝的粗细、色泽，菌丝有隔或无隔等）

无性菌丝特征

（孢子梗的分化特征，孢子着生特征等）

其他特征结构

（有无假根、足细胞、匍匐菌丝、囊轴等

1、什么叫载玻片湿室培养？

它适用于观察什么样的微生物，有何优点？

2、湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂？

3、本实验中观察假根的设计原理是什么？

此设计还适用于培养那些菌？

实验八细菌大小的测定

学会测微尺的使用和计算方法及对球菌和杆菌的测量

1、认识测微尺，学习目镜测微尺的标定

2、测定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌体的大小

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的玻片标本；

香柏油、二甲苯、显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸、吸水纸等

1、测微尺的构造显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台测微尺组成，目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm刻尺上分50份（图15-1B）。

目镜测微尺每个实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。

镜台测微尺为一专用中央有精确等分线的载玻片（图15-1A），一般将长为1mm的直线等分成100个小格，每格长0.01mm即10um，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。

2．目镜测微尺的标定把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放人目镜的隔板上，使有别度的一面朝下。

将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。

先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻