精品第四章 植物组织培养再生植株Word文档格式.docx

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另外还有胚培养；

体细胞杂交（打破物种间的生殖隔离，实现其有益基因的交流，改良植物品种，以致创造植物新类型）；

细胞突变体筛选、遗传转化等。

（二）在植物脱毒和离体快繁上的应用

应用最多、最有效。

许多植物，特别是无性繁殖植物均受到多种病毒的侵染，造成严重的品种退化，产量降低，品质变劣。

早在1943年White就发现植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒，利用茎间分生组织培养可脱去病毒，获得脱毒植株。

植物离体快繁的突出优点就是快速，而且材料来源单一，遗传背景均一，不受季节和地区等的限制，重复性好。

离体快繁比常规方法快数万倍至百万倍。

（三）在次生代谢产物生产上的应用

利用植物细胞组织的大规模培养，可以高效生产各种天然化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱、天然色素以及其它活性物质。

（四）在植物种质资源保存和交换上的应用

利用植物细胞组织培养进行低温或冷冻保存，可大大节约人力、物力和土地，还可挽救那些濒危物种。

同时离体保存的材料不受各种病虫害侵染，而且不受季节的限制，所以利于种质资源的地区间及国际间的交换。

（五）在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用：

组织培养由于能快速、大量地获得性状一致的实验材料，从而大大推动了植物遗传、生理生化和病理等领域的研究进程。

（六）产业化生产前景：

花卉种苗产业化生产；

蔬菜、水果种苗脱毒；

瓜果组培苗产业化生产。

第一节无菌培养体系的建立与增殖

细胞组织的离体培养属于无性繁殖范畴。

从理论上来说，无论是细胞还是组织培养，再生的个体均承传了母体的遗传基础，这也是离体培养技术作为植物快速繁殖应用的基础。

组织培养根据外植体的不同，可分为植株培养、器官培养（如植物的根、茎、叶、花药、子房、胚珠、胚等）、组织培养（含愈伤组织）等。

根据培养的操作方式的不同，又可分为：

固体培养和液体培养。

液体培养可分为振荡培养、旋转培养和静止培养等。

一、无菌培养体系的建立

1．培养材料的采集

从理论上讲，植物具有全能性的细胞有三类：

（1）受精卵

（2）发育中的分生组织细胞：

可取自分生组织、根尖、嫩茎、幼叶、花等；

（3）雌雄配子及单倍体细胞：

胚囊及卵细胞、花粉及精子细胞。

在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5cm左右。

但如果为培养无病毒苗，通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1mm以下。

2．培养材料的消毒

先将材料用自来水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。

在无菌环境中将材料放入70％酒精中浸泡30～60s。

再将材料移如漂白粉饱和液中或0.01％升汞（Hg2Cl2）水中消毒10min。

取出后用无菌水冲洗三四次。

3．制备外植体

在无菌的环境中，将已消毒的材料用无菌刀、剪、镊等，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳（叶片则不需去皮）。

然后切成0.2～0.5cm

厚的小片。

在操作中严禁用手触摸材料。

4．接种和培养

接种：

在无菌条件下，将切好的外植体立即接种在培养基上，每瓶接种4～10个。

封口：

接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。

温度：

培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。

增殖：

在新稍等形成后需要继代培养。

把材料分株或切段转入增殖培养基中（增殖培养基一般在分化培养基上加以改良），增殖一个月左右后，可视情况进行再增殖。

二、外植体的脱分化——愈伤组织诱导

（一）愈伤组织的形成

由外植体或单个细胞形成愈伤组织一般要经过三个步骤：

启动期：

主要是指细胞或原生质体准备分裂的时期，需要采用合适的诱导剂。

如通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。

分裂期：

即细胞开始分裂并不断增生子细胞的过程。

分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。

处于分裂期的愈伤组织的特点是：

细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。

外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。

例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；

花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；

幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。

分化期：

细胞内部开始发生一系列形态和生理上的变化，分化出形态和功能不同的细胞。

（二）愈伤组织诱导的条件

一般认为，诱导愈伤组织成败的关键主要在于培养的条件，其中，植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。

生长素：

启动细胞分裂的重要激素，是植物细胞脱分化、形成愈伤组织过程中不可缺少的物质。

常用的种类有2,4-D,IAA和NAA,所需浓度在0.01～10mg/L范围内；

细胞分裂素：

能够使已脱分化的细胞，或细胞团保持持续有丝分裂。

常用的细胞分裂素是激动素、玉米素和6-BA，使用的浓度范围在0.1～10mg/L。

生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成。

（三）愈伤组织的增殖

外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。

如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。

如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。

继代培养（Subculture）——指培养组织在培养基上生长一段时间后，营养物质枯竭，水分散失，并已积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养。

（四）优良愈伤组织的特性

1.增殖能力旺盛；

2.分散性好，容易建立优良的悬浮系；

3.有利于再分化，或得再生植株。

第二节体细胞形态发生

生物个体形成是通过形态分生实现的，建立在离体培养基础上的形态建成称之为体细胞形态发生。

在培养条件下，植物细胞经过再分化形成完整个体可以通过两种途径：

器官发生和体细胞胚发生途径。

一、器官发生途径

器官发生：

培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

（一）离体培养中器官发生的方式：

通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：

第一种方式是先芽后根（在芽产生之后，于芽形成的基部长根而形成小植株）；

第二种方式为先根后芽（在根上生长出芽来）；

第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。

（二）器官分化过程

离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段。

第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。

第二阶段是“生长中心”形成。

当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。

第三阶段是器官原基及器官形成。

在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。

这一途径有两种情况：

一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养；

另一种情况是外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。

这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。

研究表明，在叶肉细胞再生植株过程中，最初分裂细胞的第一次分裂轴向是十分重要的。

在不经过愈伤组织的器官分化中，这次平周分裂既是叶肉细胞的脱分化，同时也是该细胞转变发育方式极性的确定。

现在，有人把最先启动分裂的这些细胞称之为感受态细胞。

二、体细胞胚发生途径：

（一）体细胞胚的概念：

离体培养条件下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程中所形成的胚的类似物，统称为体细胞胚或胚状体。

（二）体细胞胚的发生途径

1.从外植体直接发生

2.经胚性愈伤组织发生

3.悬浮培养细胞发生（成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。

）

（三）体细胞胚的发生过程：

细胞脱分化后形成类胚结构，然后经历与合子胚相似的发育过程，从球形胚、心形胚、鱼雷胚到成熟胚。

（四）胚状体（embryoid）特点：

1.不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合产生；

体细胞胚与合子胚的区别：

⑴合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。

⑵合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，而体细胞胚的子叶常不规范，有时具有两片以上的子叶。

⑶与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚。

⑷体细胞胚没有休眠而体细胞胚则直接形成植株。

合子胚在胚胎发育完全进入子叶期以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。

2.不同于孤雌/雄胚，因为它不是无融合生殖的产物；

3.不同于器官发生方式形成的茎芽和根，因为它经历了与合子胚相似的发育过程且成熟的胚状体是双极性结构（即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出及茎端和根端，而不定芽和不定根都为单向极性。

）。

（五）影响体细胞胚发生的因素

（1）外源激素对体细胞胚胎发生的调控

2，4－D的应用有着规律性的变化。

首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2，4－D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素则有利于体细胞胚的继续发育。

（2）培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响

体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮。

球形胚形成后，如果降低培养基的无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。

在一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。

（3）不同基因型间体细胞胚形成能力的差异

体细胞胚的产生在不同类型的植物间具有明显差异。

在已成功获得体细胞胚的植物中，以自然条件下容易产生无融合生殖胚的植物为多，且培养条件相对较为简单，如咖啡属植物、芸香科植物等。

三、根的诱导：

继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转到生根培养基上进行培养。

1个月即可获得健壮根系。

四、组培苗的练苗移栽

试管苗进入自然环境前必须进行练苗。

一般先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的培养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中（基质使用前最好消毒）。

移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对速度98％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。

第三节植物组织培养常见问题及对策

一、褐化现象及预防

1.褐化（nonenzymaticbrowningreaction）的原因

现象:

外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡。

机理：

植物材料受伤后，体内释放的酚类物质在酚氧化酶的作用下被氧化成褐色的醌类物质。

影响因素:

褐化主要与植物材料的基因型和生理状态、取材时期、培养基以及培养条件等有关，在植物、尤其是木本植物组织培养中普遍存在。

2.褐化的预防

1）选择合适的外植体（生理状态、生长部位、种类和大小）：

一般来说，褐变随材料的年龄和组织木质化程度而增加，引起褐变的物质也因生长季节不同而有差异。

另外和外植体的种类和大小也有关系。

如：

油棕的胚培养较少褐变，而叶片因组织高度分化容易褐变川。

巨按的叶片由于因切割损伤的面积大，所产生的酚类比茎节多。

荔枝老熟的茎段揭化严重，顶芽的效果则好于侧芽。

Bongs认为外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害及褐变的程度就越大。

在卡德兰新茎的培养中也有类似的结果，新茎越大成活率越高

2）选择适宜的培养基及培养条件

在最适宜的培养条件下，外植体处于旺盛的生长状态，有较强的分生能力，便可大大减轻褐化。

油棕用改良MS,苹果使用1/2M5培养基可减轻褐化；

在初始培养时把植物的外植体处于不适合酚类合成的条件下，如在黑暗或弱光中培养，可抑制酚类的氧化。

卡德兰开始培养时，温度保持在15~20℃（温度过高使PPO的活性提高，从而加速培养的组织褐变，培养基pH调至5.5，有助于减少褐化。

3）使用抗氧化剂（VC、间苯二酚、硝酸盐）

4）使用吸附剂（活性炭、聚乙烯吡咯烷酮）

5）及时继代培养

二、玻璃化现象及预防

现象：

植物组织培养中出现的半透明状的、畸形的试管植物，试管苗的叶、嫩梢呈水晶透明、水浸状，植株矮小肿胀、失绿，叶片邹缩卷曲，无功能性气孔，无栅栏组织，体内含水量高。

尚不很清楚，可能是培养基渗透势不当，导致乙烯产生，进而激发其它激素和酶的活性，抑制蛋白质、纤维素和木质素的合成，促进叶绿素的分解，形成玻璃苗。

目前研究认为是植物细胞分裂与体积增大的速度超过了干物质生产和积累的速度，植物只好用水分来充涨体积，从而表现玻璃化。

第四节人工种子（Artificialseeds）

一、人工种子的概念

将植物离体培养产生的体细胞胚包埋于含有营养成分和保护功能的物质中，在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。

（Kamada,1985）

任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均或称之为人工种子。

（陈正华等，1998）

二、人工种子的优点

1.建立高效快速的植物无性繁殖方法（无性繁殖植物）。

2.对于制种困难的优异杂种种子可以快速获得大量种子。

3.用于快速繁殖不能正常产生种子的特殊植物材料。

4.与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制。

5.与利用试管苗相比，可避免移栽困难，实现机械化操作，便于储藏和运输。

三、人工种子的生产流程

1.繁殖体的人工诱导与生产增殖

2.繁殖体的筛选和预处理

3.人工种子的包埋

在制造单胚人工种子的时候，主要采用藻酸钠一类的水凝胶作为体细胞胚的包被物质。

藻酸钠（2%~3.2%，W/V）在室温下为液体，很适合于制造人工种子。

当体细胞胚与藻酸钠混合后，再滴入硝酸钙或氯化钙溶液（100mmol/L）中，30min内表面即可完全络合，形成一层持久的种皮。