CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书Word格式文档下载.docx
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CRISPR核酸载体使Cas9与CRISPRRNA为基础的表达细胞的富集。
线性GENEART®
CRISPR核酸载体提供快速和有效的方式来克隆编码所需CRISPRRNA靶到表达盒，允许Cas9核酸序列中的特定的方式靶向的双链寡核苷酸。
虽然该工具包被设计来表达Cas9和引导RNA的代表以最简单，最直接的方式，使用该试剂盒的基因组编辑和靶位点的特定靶序列裂解分析假设用户熟悉的CRISPR系统，载体的原则为基础的生产CRISPRRNA，并转染哺乳动物系统。
我们强烈建议用户拥有CRISPR系统的工作知识。
2.1.2该CRISPR系统
在CRISPR系统是一种使用RNA指导的DNA核酸酶沉默病毒核酸（Jinek等人，2012）原核适应性免疫系统。
在细菌中CRISPR位点组成的串联重复序列由外源DNA片段的分离（〜30bp的长度），称为间隔件。
的重复间隔件阵列被转录为一个长的前体和重复序列内被处理，以产生用于指定由CRISPR核酸酶裂解的靶序列（也被称为protospacers）小crRNAs。
CRISPR间隔物，然后用于识别和沉默的RNA或DNA水平的外源遗传元件。
必不可少的裂解是一个序列基序紧接在目标区的3'
端，被称为protospacer相邻的基序（PAM）的下游。
在PAM中存在的靶DNA，但不能靶向它的crRNA。
2.1.3基因组编辑
基因组编辑包括使用在与内源性修复机制一起使用的设计好的核酸，以从基因组DNA中的特定位置中插入，删除或取代DNA序列。
设计好的核酸酶在基因组中的特定位置诱导双链断裂（DSB），在这之后的内源性修复机制通过非同源末端连接（NHEJ）或同源性定向修复修复断裂。
II型CRISPR系统已被证明可作为在各种生物体，包括哺乳动物细胞的基因的编辑工具。
（Mali1等人，2013;
cong等人，2013）。
它由三部分组成：
CRISPR相关Cas9核酸（双链DNA的核酸内切酶），靶互补CRISPRRNA（crRNA），和一个辅助反式激活crRNA（tracrRNA）。
该crRNA和tracrRNA作为一个短导的RNA为目标的Cas9核酸酶对特定基因组位点（图1）。
图1CRISPR/Cas9介导的靶DNA裂解示意图
该crRNA和GENEART®
CRISPR核酸载体的tracrRNA可以表示在一起为指导RNA，模仿在细菌系统自然crRNA-tracrRNA杂交。
引导RNA的表达是由U6polIII启动型的启动子（图2）驱动。
在GENEART®
CRISPR核酸载体图2指南的RNA表达盒。
该系统具有通用性，且易于使用，改变目标专一只需要变更CRISPRRNA的设计即可。
3方法
3.1实验轮廓
下表和图列出了创建你的GENEART®
CRISPR核酸酶载体和表达它的细胞所需的步骤。
步骤
操作
1
设计的单链DNA寡核苷酸。
2
退火单链寡核苷酸，以产生一个双链寡核苷酸
3
稀释双链寡核苷酸对到工作浓度
4
克隆双链寡核苷酸到CRISPR核酸载体上
5
转化OneShot®
化学感受态TOP10E.coli细胞，并选择表达克隆
6
通过测序分析转化子中存在的插入
7
制备纯化的质粒DNA，转染所选择的细胞系
图3靶定特异的ds寡核苷酸的克隆和分析
退火编码靶定特异的crRNA
用T4DAN连接酶克隆退火的oligo到线性化的Cas9核酸酶报告载体上
转化到E.coli感受态细胞中，筛选想要的CRISPR克隆
为基因编辑而进行转染、富集和筛选
3.2设计单链DNA寡核苷酸
3.2.1介绍
要使用GENEART®
CRISPR核酸载体试剂盒，你首先需要设计带有两个单链DNA寡核苷酸突出段来与线性化的载体互补;
一个编码靶CRISPRRNA（正链寡核苷酸），而另一个与其互补（反向链寡核苷酸）。
然后，将退火的顶部和底部链寡核苷酸，以产生一个双链寡核苷酸（DS寡核苷酸）以适于克隆到试剂盒中提供的线性载体中。
单链（ss）寡核苷酸的设计是两个克隆过程的成功是至关重要的。
一般准则是提供在本节，以帮助您选择了靶序列，并设计了ss的寡核苷酸。
请注意，对于一个给定的靶基因，你可能需要产生和筛选多个crRNA序列，在其中找出一个在有效地裂解你的目标基因位点是活跃的。
3.2.2选择靶序列
当执行CRISPR/Cas9诱导的DNA上的特定基因或基因位点双链断裂，您选择靶序列可以显著影响裂解观察到的程度。
当选择你的靶定序列时，我们推荐下面的指导方针。
这些只是一般性建议;
可能发生例外。
长度：
选择的靶序列，从19到20个核苷酸长度的邻近一个NGG原垫片相邻的基序（PAM）的序列上的靶序列的3'
末端。
注意：
需要从U6polIII启动子转录起始的5'
G是已经包含在突出端，并且不需要被包括在靶序列中。
同源性：
确保靶序列不包含显著的同源性的其他基因，因为这可以增加脱靶效应。
最近发表的工作表明，指导gRNA-Cas9复合物有可能容忍高达1-3的不匹配。
更多见解的选择靶序列参见刊登的文章。
（Fu等，2013;
Mali2等人，2013）。
定位：
您可以选择靶序列编码靶基因的有义序列或反义序列。
因此，您可以在提供其符合在3'
端PAM的需求两个可能的方向产生CRISPRRNA。
3.2.3需要定向克隆的序列
选择19-20个碱基对的靶序列后，继续设计crRNA特异性寡核苷酸引物。
重要！
在寡核苷酸引物中不包括PAM序列。
要启用DS的定向克隆寡核苷酸进入GENEART®
CRISPR核酸载体，你必须添加以下5个核苷酸到相应的ss寡核苷酸的3'
端：
•上链低聚核苷酸加入GTTTT到所述寡核苷酸的3'
该GTTTT是互补的突出端序列，CAAAA，在线性CRISPR核酸载体（参见图3），并构成tracrRNA的前5个碱基。
底链寡核苷酸：
底部链寡核苷酸应该是靶序列的反向互补。
加CGGTG到所述寡核苷酸的3'
这个序列是互补的突出端序列，CACCG，在线性GENEART®
CRISPR核酸载体（参见图3），并构成U6启动子的最后4个碱基和所需polIII启动转录起始位点的第一个碱基。
退火两条单链寡核苷酸产生带有为克隆入GENEART®
CRISPR核酸载体合适末端的双链寡核苷酸。
3.2.4制备双链寡核苷酸
3.2.4．1介绍
退火每单链寡核苷酸的相等量，以产生一个双链（ds）的寡核苷酸。
退火后，稀释ds等分寡核苷酸从50μM到5nm的工作浓度。
3.2.4．2所需材料
•正向链寡核苷酸（200uM的水或TE缓冲液）
•反向链寡核苷酸（200微米的水或TE缓冲液）
•50uM的库存的ds对照寡核苷酸（融冰）
•10X寡核苷酸退火缓冲液
•DNA酶/RNA酶的水（用试剂盒中提供）
•1.5毫升无菌离心管
•95℃热块
3.2.4．3退火过程
1、在室温下在干净的微量离心管中加入以下试剂。
正链寡核苷酸（200微米）5微升
反向链寡核苷酸（200微米）5微升
10X寡核苷酸退火缓冲液2μL
DNA酶/RNA酶的水8μL
总量20μL
2，重新退火的DS克隆控制寡。
短暂离心（〜5秒），转移5μL到一个干净的离心管中，然后继续下一个步骤。
此过程也适用于当重新退火等50uM的ds寡核苷酸。
3，在加热块孵育管中于95℃进行4分钟。
4，从散热块中取出管，并让反应混合物冷却至25℃进行5-10分钟。
5，离心管短暂（约5秒）。
轻轻混匀。
6，继续进行稀释双链寡核苷酸
对于长期储存，保持50μMDS寡核苷酸贮备液在-20°
C。
3.2.4．4准备稀释的双链寡核苷酸
单链寡核苷酸和克隆控制寡核苷酸退火后，进行两个稀释：
50μM的ds100倍连续稀释寡核苷酸库存，制备500nM的DS寡核苷酸原液（100倍稀释），和一个为5nM的ds寡核苷酸工作溶液（10,000倍稀释）。
准备500nM的原液准备一个500uM的ds寡核苷酸原液稀释50μMDS寡核苷酸库存100倍。
1，混合下列试剂在一个干净的离心管中：
50μMds寡核苷酸库存1μL
DNA酶/RNA酶的水99μL
总量100μL
2，旋涡混匀。
对于长期储存，保持500nM的DS寡核苷酸贮备液在-20°
3.2.4．5准备5nM的工作液
准备一个5nM的ds通过稀释500nM的DS寡核苷酸原液100倍寡核苷酸工作液。
注意：
为5nM的ds寡核苷酸工作溶液不适于长期储存，并应在每次新鲜制备。
500nM的DS寡核苷酸溶液1μL；
10X寡核苷酸退火缓冲液10μL；
DNA酶/RNA酶的水89μL；
总成交量100μL
2，旋涡混匀。
处理双链寡核苷酸的溶液
•在冰上解冻冷冻的ds寡核苷酸的溶液。
•切勿加热或允许的ds寡核苷酸溶液温度上升高于室温。
ds的加热寡核苷酸中部分变性的溶液的效果，并且在克隆效率的降低。
o如果500nM的储备液，或5nM的工作液温度过高，准备新的稀释溶液。
o如果50μMDS寡核苷酸库存变热，再退火的寡核苷酸。
3.2.4．6处理双链寡核苷酸溶液
•解冻冷冻DS寡核苷酸在冰上的溶液。
•切勿加热或允许的DS寡核苷酸溶液温度上升高于室温。
ds的加热寡核苷酸中部分变性的解决方案的效果，并且在克隆效率的降低。
o如果50uM的ds寡核苷酸库存变热，再退火寡核苷酸。
4连接反应
4.1介绍
一旦你生成你的ds寡核苷酸，并准备相应的储备液，克隆ds寡核苷酸进入GENEART®
CRISPR核酸载体。
4.2所需材料
•双链寡核苷酸（5uM的1X寡核苷酸退火缓冲液，在解冻后使用冰）•双链控制寡核苷酸（5uM的1X寡核苷酸退火缓冲液，在解冻后使用冰）•线性GENEART®
CRISPR核酸向量（使用前解冻冰）•5X连接缓冲液（用试剂盒中提供）•DNA酶/RNA酶的水（用试剂盒中提供）•T4DNA连接酶（与试剂盒中提供）
4.3对照
我们建议，包括试剂盒提供的阳性对照在你的结扎实验DS控制寡核苷酸。
在DS控制的寡核苷酸被提供作为在1X寡核苷酸退火缓冲液为50μM的股票，并且需要被重新退火和稀释10,000倍的连接反应使用之前。
如果你想有一个阴性对照，建立一个单独的连接反应，但省略了DS寡核苷酸。
4.4连接步骤
在室温下对于每个ds寡核苷酸被克隆的建立具有20μL的连接反应。
1、按照显示的顺序加入下列试剂到一个干净的离心管中：
5X连接缓冲液4μL
CRISPR核酸载体2μL
DS寡核苷酸（5纳米）2μL
DNA酶/RNA酶的水11μL
T4DNA连接酶1μL
2、混合反应：
向上和向下吹打。
注：
PEG的存在和甘油（由连接缓冲液和T4DNA连接酶提供）将造成反应混合物的粘性。
一定要通过上下吹打调匀反应。
不要旋涡。
3，孵育10分钟，在室温下（25-27℃）。
孵育时间可以延长到2小时，并可能导致较高的产率的菌落。
4，置于冰上反应，并进行TransformOneshot®
TOP10感受态大肠杆菌。
您可以储存剩余的连接反应在-20℃过夜
2.5转化感受态大肠杆菌细胞
2.5.1介绍
一旦你已经完成了连接反应，转化OneShot®
TOP10化学感受态大肠杆菌与由此产生的CRISPR核酸结构。
OneShot®
TOP10化学感受态大肠杆菌是理想的高效率克隆和质粒传播。
他们允许高拷贝数质粒稳定复制。
TOP10细胞的基因型是类似于DH10B™菌株。
为每个连接反应，OneShot®
TOP10大肠杆菌需要一管。
2.5.2所需材料
•连接反应（从第4步，第8页）
•（可选）pUC19控制（带试剂盒中提供）
•OneShot®
TOP10化学感受态大肠杆菌细胞（用试剂盒中提供）
•S.O.C.培养基（暖至室温后再使用）
•含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板（2个：
为每个转化;
温暖，在37℃，30分钟）
•42℃水浴
•37℃振荡和非振荡培养箱
2.5.3OneShot®
TOP10转化程序
1，解冻OneShot®
TOP10化学感受态大肠杆菌，并继续进行下一步的细胞解冻后立即使用。
2，添加连接反应3μL（从第4步，第8页）OneShot®
TOP10化学感受态大肠杆菌的小瓶中，并通过涡旋或轻敲管轻轻轻轻混匀。
不要上下吹打混匀。
如果执行阳性对照的转化效率，转化1μL的的pUC19质粒。
3，将管立即放置在冰上，并孵育10-30分钟。
长时间孵育似乎对转化效率的影响最小。
在培养的长短是在用户的决定。
4，热激细胞30秒，在42°
C，无晃动。
5，紧随管转移到冰。
6，加入250μL的的室温S.O.C.培养基。
7，盖上管紧密，摇管水平（200转），在37℃下1小时。
8，差价50微升来自于含有100微克/毫升氨苄青霉素的一个预热的LB琼脂平板上的转化反应。
镀上的第二预热的LB琼脂平板上反应的剩余部分。
过夜孵育所述板在37℃下
我们建议放置两种不同的体积，以保证至少有一个板具有良好的间距菌落。
如果你正在改变的pUC19对照，在含100μg/mL氨苄青霉素的预热的LB平板放置20-100μL的转化。
9，一个高效的连接反应可在总共产生了100个的菌落。
挑选5-10菌落进行分析（见分析转化，第10页）。
3．4分析转化子
3．4．1确认阳性克隆
通过测序在阳性转化子中确认ds寡核苷酸插入的身份。
分析每个CRISPR核酸结构来验证：
•该DS寡核苷酸插入存在，并且在正确的方向•该ds寡核苷酸插入有正确的序列
限制分析是推荐的，由于ds寡核苷酸插入的小尺寸。
3．4．2分析转化子
1，在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基，37℃下挑选5-10个氨苄青霉素抗性菌落并培养它们过夜
2，使用您选择的方法提取质粒DNA。
我们建议使用的PureLink®
HQ迷你质粒纯化试剂盒。
3，进行使用U6正向引物（与试剂盒提供）的CRISPR核酸结构的测序。
4，制作所需的CRISPR核酸表达质粒的甘油库存（见长期储存）。
5，继续进行转染（第11页）。
3．4．3测序指导
如果一个特定的CRISPR核酸结构是很难顺序，遵循这些建议，以改进的结果：
•使用高品质，纯化的质粒DNA进行测序。
HQ迷你质粒纯化试剂盒（货号K2100-01）制备DNA。
•添加DMSO，测序反应，以5％的最终浓度。
•增加模板的测序反应（至正常浓度的两倍）的使用量。
•在你的测序反应使用的dITP：
三磷酸的7:
1摩尔比。
3．4．4长期储存
一旦正确的CRISPR核酸构建体被识别，甘油库存用于长期存储。
1，在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板在原始菌落上加上f的条纹，孵育过夜在37°
C
2，分离单个菌落，接种于1-2毫升含100μg/mL的氨苄青霉素LB培养基中。
3，在37°
C，直到培养物达到稳定期。
4，混合0.85毫升培养与0.15毫升无菌甘油和转移到离心管。
5，存放甘油于-80℃
3.5哺乳动物细胞系转染
3.5．1转染的方法
转染质粒导入哺乳动物细胞系的方法包括磷酸钙（Chen和Okayama，1987;
Wigler等人，1977），脂质介导的技术（Felgner等人，1989;
Felgner和Ringold，1989），以及电穿孔（储等。
对于范围广泛的哺乳动物细胞系的高效率转染，我们建议使用阳离子脂质为基础的脂质体®
2000试剂（货号11668-027）（Ciccarone等，1999）。
，1987;
Shigekawa和道尔，1988）。
细胞系转染的最佳方法查阅相关文献或者供应商。
要特别注意培养基的要求，何时传递细胞，以及在什么稀释分裂细胞。
3.5．2质粒制备
的转染真核细胞质粒DNA必须是纯净，不受苯酚和氯化钠的污染。
我们建议您使用高品质的maxi准备的DNA用于转染。
商店质粒DNA库存在-20°
3.5．3转染
指引以下一般原则，建议在一个标准的6孔板进行转染：
•用脂质体转染®
2000进行转染与大多数细胞系。
•在转染当天种子细胞达到70％的汇合。
结果将随与细胞类型接种密度而变化。
•有3微克CRISPR/Cas9表达载体的转染执行。
结果将依赖于细胞类型和传代数量，和脂质：
DNA的最适浓度取得最佳效果是需要的。
富集的种群使用任何OFP或CD4报告转GENEART®
CRISPR核酸载体的详细信息，请参阅附录B（第18页）。
3.5．4对照
我们建议您包括阳性对照和阴性对照（模拟转染）在实验来评估你的的结果。
3.5．5故障排除
观察的现象
原因
解决方法
选择性平板获得的氨苄青霉素抗性菌落数少
单链寡核苷酸设计不正确
对于克隆到GENEART®
CRISPR核酸载体，确保每个单链寡核苷酸3'
末端包含5个核苷酸
•顶部链寡核苷酸：
包括3'
端GTTTT。
•底部链寡核苷酸：
端CGGTG
DS寡核苷酸降解
•存放5nM的DS寡核苷酸股票在1X寡核苷酸退火缓冲液。
•避免重复冷冻/解冻循环。
分装在5nM的DS寡核苷酸库存并储存于-20°
寡核苷酸退火反应效率低
•确保按照指示（第6页）进行退火反应。
•如果环境温度>
25°
C至27°
C，在25℃培养箱中孵育退火反应。
4．附录A
CRISPR核酸载体的图谱和特点
4．1GENEART®
CRISPR核酸载体
下图显示了GENEART®
CRISPR核酸载体的功能。
该载体被提供线性化的核苷酸在7335和7356（CD4）或6732和6752（OFP）与每条链上所指示的5个碱基对的3'
突出端。
载体的完整序列是可以从我们的网站（）下载或联系技术支持（请参见第16页）
CRISPR核酸载体的特点
CRISPR核酸酶载体（9822bp的CD4和9219bp的OFP）包含以下元素。
所有的特点进行了功能性测试和载体的完全测序
特点
优点
tracrRNA
辅助反式激活crRNA允许载入Cas9核酸到gRNA
复制的F1原点
复制起点
pATK
聚腺苷酸化信号
CD4
基于富集的微珠报告基因，当用荧光标记的抗CD4抗体（睫状体等人，1995）染色，可用于监测转染效率
OFP
基于分选的流式细胞仪报告基因，荧光蛋白质也可用于监测转染效率
2A肽连接
一种自我裂解肽接头物，可以将CD4或OFP报道基因连接到Cas9核酸酶的C-末端。
紧接翻译，2A肽侧翼的彼此分隔。
CMV启动子
允许Cas9核酸酶和CD4或OFP报告基因的表达
人U6启动子
允许RNA聚合酶Ⅲ-依赖的指导RNA（gRNA）的表达
U6正向引物位点
允许插入片段的测序
3'
突出端
允许感兴趣的双链寡核苷酸的连接酶介导的定向克隆
聚合酶III终止子
可有效终止的RNA聚合酶III-依赖的转录
氨苄青霉素抗性基因
允许在大肠杆菌中选择质粒
pUC的复制起点
在大肠杆菌中允许高拷贝和维持
5.附录BGENEART®
CRISPR核酸酶表达细胞富集
5.1介绍
CRISPR核酸载体转染的细胞（与OFP或CD4记者）的种群可以使用荧光激活细胞分选（FACS）富集，或者在CD4报告基因载体的情况下，采用Dynabeads®
CD4磁珠。
5.2流式细胞仪富集
请遵循以下准则，以富集转染有GENEART®
CRISPR核酸酶（OFP记者）载体的细胞：
•收获活的转染的细胞，为正在使用的细胞系重悬在FACS缓冲液。
例如，0.2微米的无菌过滤的FACS缓冲液（1XPBS中含有1mMEDTA，25mM的HEPES，1％FBS），可以很好地用于粘附细胞系，如HEK293。
•OFP有548nm的峰值激发和560nm发射。
o一个488nm激光被推荐用于高效率的激发。
o标准530/30,574/26和603/48发射器被推荐用于检测。
最优收集缓冲器，将取决于所选择的下游应用，但含2％FBS和FACS缓冲液（见上文）的RPMI培养基都是可行的方案。
图1由GENEART®
CRISPR核酸OFP载体转染的细胞时由488激光激发，并通过不同的检测器测得的ΔMFI（平均荧光强度）
请遵循以下准则，以丰富GENEART®
CRISPR核酸酶（CD4报告）转染载体的细胞：
•收获活转染的细胞，为正在使用的细胞系重悬在FACS缓冲液。
•染色细胞与CD4抗体结合到你所选择的荧光团（根据制造商的说明）。
•一旦染色，GENEART®
CRISPR核酸酶（CD4报告）载体转染的细胞可以通过流式细胞仪（见上文）富集。
5.3使用CD4磁珠富集
CRISPR核酸酶（CD4报告））载体转染的细胞可以用磁珠®
CD4磁珠（货号11331D）富集。
我们在使用本产品时，建议使用以下协议：
1，收获转染的活细胞和离心机在400×
g离心5分钟。
2，倒出上清，重悬在2ml缓冲液I（0.2微米无菌过滤的PBS，0.1％BSA，2mMED
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