板蓝根F022部位抗内毒素分子机理研究Word下载.docx

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F022部位；

内毒素；

分子机理

　　StudiesontheAntiendotoxicMolecularMechanismofF022fromRadixIsatidis

　　Abstract：

ObjectiveTostudytheanti-endotoxicmolecularmechanismofF022fromRadixIsatidis.MethodsThecontentofF022pretreatedETwasquantitativelydeterminedwithlimulustest．TheinhibitionofTNFαandIL6ofmurineperitonealmacrophagesstimulatedbyLPS,themolecularexpressionofmoesinmRNA,MAPKp38,TNFα,IL6andNOinmicetissuesinducedbyLPSwerestudiedontheantiendotoxicmechanismofF022.ResultsItwasfoundthattheETreductionratewas%,if1%F022wasaddedtomacrophagesculturebeforeadditionof50ng&

#12539;

ml1LPS．ProductionofTNFα,IL6andMAPKp38bymacrophageswereinhibitedinvitro．F022remarkablydecreasedthemolecularexpressionofmoesinmRNAinliver，kidney，spleeninducedbyLPSinmiceandinhibitedproductionofTNFα,IL6andNOinmicestimulatedbyfromRadixIsatidiscannotonlydestroythestructureofendotoxin,butalsoobstructthesignaltransductionpathwaysofLPS.F022maybeastrongantiendotoxinfractionindrugsresearchanddevelopment.

　　Keywords：

RadixIsatidis;

F022fraction;

Endotoxin;

Molecularmechanism

　　内毒素（endotoxin，ET）是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS）成份。

可刺激机体防御系统过度释放炎性因子肿瘤坏死因子（TNFα）、白细胞介素6（IL6）及一氧化氮（NO）等而引发发烧、脓毒性休克、弥漫性血管内凝血（DIC）、多器官功能衰竭综合征（MODS），以至死亡。

中医对内毒素性疾病的初期表现常辨证为“实热证”，内毒素是“热毒、邪毒”的物质基础［1］。

有关内毒素的研究一直是世界生物医学研究热点，而内毒素拮抗药的研究那么是防治内毒素性疾病的重要策略之一。

先前研究已证明板蓝根有抗大肠杆菌O111B4内毒素作用［2，3］，咱们从中挑选出抗内毒素活性强的F022部位［4，5］，为进一步探讨F022部位抗内毒素机理，本文研究了F022部位对内毒素致体内外分泌TNFα，IL6和NO的阻碍及对内毒素受体-膜结构伸展刺突蛋白（moesin）和内毒素介导的胞内信号传导进程中丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatingproteinkinases，MAPK）p38激酶的阻碍。

现报导如下。

　　1器材

　　药品与试剂F022部位（本室制备）,冻干细菌内毒素工作标准品（E．coliO111B4，卫生部上海生物制品研究所，120EU／支）；

Tris缓冲液（pH7．2）；

细菌内毒素（4mg/支，中国药品生物制品检定所）；

TNFα和IL6试剂盒（北京邦定泰克生物）；

新生小牛血清（NBS，沈阳安迪生物高科技公司）；

RPMI1640细胞培育液（Gibco公司）；

%氯化钠注射液%NS，连云港制药厂）；

LPS（E．coliO2B，5mg/支，Sigma公司）用0．9%NS配制成100g&

L1；

卡介苗（BCG，50mg/支,上海生物制品研究所），实验前用%NS配成10mg/ml；

moesinmRNA原位杂交试剂盒（武汉博士德生物公司），32P（DupontNEN产品），MAPKp38多克隆抗体（Sigma公司），MBP（髓磷脂碱性蛋白，Sigma公司）。

　　1%F022溶液配制取F0221g，加适当PEG4000作助溶剂，加热熔化，加水稀释到100ml，用NaOH液调pH6～7，灭菌消毒备用。

　　动物C57BL／6小鼠（雌性，6～8周龄，华中科技大学同济医学院器官移植研究所）；

昆明种小鼠（17～22g，3周龄，雌雄各半，华中科技大学同济医学院实验动物中心）；

BALB／C小鼠（14～19g，华中科技大学同济医学院实验动物中心）。

　　仪器EDS98型细菌内毒素检测仪（北京金山川科技进展）；

XW型旋涡混合器（上海医科大学研究所）。

1815TC型CO2培育箱（Shel-Lab公司）；

MK3型酶标仪（LabsystemDragon公司）。

　　2方式

　　F022破坏内毒素定量测定

　　内毒素液配制取内毒素工作标准品（120EU／支）加入1ml细菌内毒素溶解水，于旋涡混合器振荡30s，即成120EU／ml内毒素液。

　　标准曲线制备别离取内毒素液适量，用细菌内毒素溶解水稀释成，，，，和EU／ml系列内毒素浓度（c），各取0．2ml加入鲎试剂中（双管法），旋涡混合器振荡后迅速插入内毒素定量测定仪，记录凝胶形成时刻（Tg），用logTg对lgC作图，得标准曲线lgTg=49~26lgC，r=5，内毒素在～EU/ml浓度对数与凝胶形成时刻的对数呈线性关系，最低检出限为EU/ml。

　　回收率按上述方式，取鲎试剂5支，别离周密加入浓度为4EU/ml内毒素液ml，测定凝胶形成时刻，按标准曲线计算浓度为±

EU/ml，回收率为±

%。

　　样品测定取mlF022液与ml内毒素液混合，于水浴（37±

1）℃温育（60±

2）min，取ml溶液加入ml细菌内毒素溶解水，此为样品组，同时设立阳性对照组和阴性对照组，测定内毒素浓度。

F022对内毒素的破坏率为：

［1（样品组阴性对照组）/（阳性对照组阴性对照组）］×

100%。

　　F022对脂多糖致鼠巨噬细胞分泌TNFα和IL6的阻碍

　　鼠巨噬细胞制备按文献［6］，取C57BL/6小鼠，腹腔注射BCG2mg/只，4d后拉颈处死动物，在无菌条件下注入冰凉的RPMI1640培育液5ml（含80U&

ml1青霉素，100μg&

ml1链霉素，10U&

ml1肝素），轻揉腹部数次，抽取腹腔液，离心1500r/min，用无血清的RPMI1640洗涤细胞2次，加入含10%灭活小牛血清的RPMI1640培育液，调整细胞浓度为2×

106个/ml，加入24孔培育板内，每孔1ml，置37℃,5%CO2培育箱内培育2h后，用无血清的RPMI1640洗去非粘附细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞。

　　TNFα和IL6的诱生按文献［5］将含1%样品液预处置巨噬细胞1h后，再加入终浓度为50ng&

ml1的LPS，另设阴性对照组（RPMI1640液）和阳性对照组,别离培育6h和24h后取上清液，于20℃保留待测。

　　TNFα和IL6的定量检测ELISA法测定各标准品和样品光密度值（OD）,以各标准品浓度对OD值作标准曲线，结果说明TNFα和IL6浓度在~10ng&

ml1范围内与OD值具有良好的线性关系。

由标准曲线求算出待测样品的TNFα和IL6的含量，作统计学t查验。

TNFα抑制率=［1（样品组空白对照组）/（模型组空白对照组）］×

IL6抑制率的计算方式同上。

　　F022对脂多糖诱导P38丝裂原活化蛋白激酶的阻碍

　　细胞液制备与药物处置按的方式制备细胞液，转移至24孔培育板上，于无菌培育箱中培育。

将含1%F022的培育液1ml预处置巨噬细胞1h后，再加入终浓度为50ng&

ml1的LPS，另设阴性对照组和阳性对照组,别离培育6h后，检测细胞内MAPKp38活性。

　　蛋白激酶MAPKp38活性测定按文献［7］，每孔细胞经冰凉磷酸缓冲液洗涤后加入1ml细胞溶解液，细胞经冻融处置，离心（12000r／min，4℃，30min），取上清ml与5μg特异性MAPKp38抗体于4℃一起孵育4h，搜集免疫复合物与预先吸附有抗鼠的琼脂培育基孵育30min，沉淀下的蛋白加入溶解液在25℃孵育25min，取100μl点于P8/phosphocellulose（磷酸纤维素滤纸）上，在液体闪烁仪上测定髓磷酸脂碱性蛋白32P的掺入量，结果以每分每毫克蛋白掺入32P的pmol数（pmol/mg&

min表示）。

　　F022对脂多糖刺激鼠组织moesinmRNA表达阻碍

　　标本制备将18只小鼠随机分为样品组（A）、阳性对照组（B）、阴性对照组（C），每组6只。

实验前一周腹腔内注射BCG2mg/只,实验前12h禁食不由水，实验当天给予A、C组1%样品液ml/只，B组给予一样量%NS灌胃，30min后，A、B组小鼠尾静脉注射LPS800ng/20g，9h后乙醚麻醉，取肝、脾、肾组织，当即用4%多聚甲醛固定。

　　moesinmRNA原位杂交按常规操作将各组织切片，脱蜡入水，3%双氧水室温处置10min以灭活内源性过氧化物酶，暴露mRNA核酸片段；

切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化25min。

充分洗涤后，按每张切片加20μl含寡核苷酸探针的原位杂交液。

于湿盒中，37~40℃杂交留宿。

每张切片取2μl杂交探针稳固液A和18杂交探针稳固液B混匀，加在切片上，再反映6h，2×

SSC洗涤5min3次。

滴加封锁液，37℃20min。

滴加兔抗地高辛，37℃60min。

充分洗涤后，滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃20min。

充分洗涤后，滴加SABC，37℃20min。

DAB显色20~30min，用苏木素复染，充分水洗。

酒精脱水，二甲苯透明，封片。

镜下观看胞浆着色呈棕黄色者为阳性。

　　F022对脂多糖诱导鼠体内TNFα，IL6和NO的抑制作用

　　血清样品制备按的方式分组给药，9h后，乙醚麻醉，眼眶内取血，静置后取血清，-20℃贮存备用。

　　TNFα和IL6检测按的方式检测并计算抑制率。

　　NO检测采纳Griess试剂法。

取待测血清50μl，加入等体积的Griess试剂，室温放置反映10min，应用酶联免疫检测仪在550nm波长下测定样品的吸光度。

　　3结果

　　F022对内毒素的破坏作用1%F022液对内毒素的破坏率为%。

　　F022对LPS处置巨噬细胞分泌TNFα和IL6的阻碍结果说明，F022能抑制巨噬细胞分泌TNFα和IL6；

抑制率别离为%，%。

结果见表1。

表1F022对LPS致鼠腹腔巨噬细胞分泌TNFα和IL6的阻碍（略）

　　F022对LPS诱导鼠蛋白激酶MAPKp38的阻碍药物组的MAPKp38活性与阴性对照组比较不同无显著性，而单纯LPS组，MAPKp38活性升精湛显，不同有极显著性意义（P&

lt;

。

结果见表2。

表2F022对LPS诱导鼠蛋白激酶MAPKp38的阻碍（略）

　　F022对脂多糖刺激鼠组织moesinmRNA表达的阻碍图像分析采纳北航医学图像处置系统给予原位杂交显色强度计分。

计量资料用t查验，计数资料用χ2查验。

结果见表3。

由表3可见，SA可抑制LPS刺激小鼠组织moesinmRNA表达，且在不同组织有明显不同，肝和肾内表达强于脾脏。

表3F022对脂多糖刺激鼠组织moesinmRNA表达的阻碍（略）

　　F022对LPS诱导鼠体内TNFα，IL6和NO的抑制作用小鼠经不同浓度F022部位处置后再给予一样剂量LPS，其血清中TNFα、IL6和NO浓度及抑制百分率见表4。

由表可见，板蓝根有效部位对LPS刺激小鼠体内释放TNFα，IL6和NO有抑制作用。

表4F022对LPS诱导鼠体内TNFα，IL6和NO的抑制作用（略）

　　4讨论

　　细菌内毒素与靶细胞彼此作用可表现出普遍的生物学活性，从分子水平上看，该作用要紧通过内毒素和其受体之间特异性结合来介导，LPS与受体结合后，通过G蛋白偶联，激活蛋白激酶，完成信号跨膜转导，激活单核巨噬细胞，增进TNFα，IL6，NO等炎性因子的释放。

咱们前期研究证明［3~5］，板蓝根F022能直接中和LPS，破坏其超微结构。

本文对F022部位的内毒素破坏作用了定量研究，发觉1%F022液对内毒素破坏达到%，在内毒素致病的信号传导进程中，内毒素受体起了关键性作用。

目前，已发觉的内毒素受体要紧有CD14、膜结构伸展刺突蛋白（moesin）、钟声类蛋白、低密度脂蛋白等，其中与致病关系紧密的是CD14，moesin和钟声类蛋白。

国外有研究说明，应用moesin单克隆抗体可阻止LPS的生物效应达90%以上，而CD14的抗体却只能拮抗LPS生物效应50％左右［8］。

因此，本课题选择moesin作为内毒素受体的检测对象，结果显示，按800ng&

20g1LPS刺激后小鼠9h后的肝、肾、脾内moesinmRNA表达较明显，其计分值与对照组比较，不同有极显著性。

而预先给予1%F022液的小鼠，其计分均较LPS组低，可见板蓝根可阻碍LPS刺激的moesinmRNA的分子表达程度。

　　MAPKp38激活是胞内信号传导很重要的环节，通过激活MAPKp38，启动效应分子如肿瘤坏死因子TNFα，IL6，NO等的基因表达和产生，由此致使一系列的病理生理反映［9］。

从板蓝根对抑制LPS诱导的蛋白激酶MAPKp38活性实验结果可见，LPS对F022液的预处置的巨噬细胞MAPKp38活性未见明显增强，体内外TNFα、IL六、NO水平无明显上升，与单独加入LPS后这些指标显著增高相较，不同有极显著性意义（P&

0．01）。

可见板蓝根可特异性抑制由LPS介导的MAPKp38活性。

　　参考文献：

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