整理基因工程实验手册Word格式.docx

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限制性内切酶能识别并切割特异位点的DNA序列。

其被广泛应用于载体构建。

提取的质粒DNA，利用限制性内切酶EcoRI（GAATTC）进行酶切，可将目的基因切下。

酶切结果可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

二、实验材料

PCR胶回收产物，pGEM®

-TEasyVector（Promega），已制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞

三、实验仪器

PCR仪、制冰机、水浴锅、37℃摇床、离心机、涡旋振荡器、电泳槽

四、实验试剂

1.SolutionⅠ（0-4℃保存）:

50mmol/L葡萄糖；

25mmol/LTris·

Cl（pH8.0）；

10mmol/LEDTA（pH8.0）

2.SolutionⅡ（现配现用）:

0.2mol/LNaOH；

1%SDS

3.SolutionⅢ（0-4℃保存）:

0.2mol/LKAC60mL；

冰乙酸11.5ml；

ddH2O28.5ml（pH4.8）

4.Rnase:

100mgRnase粉剂，溶于10ml10mmol/LTris·

Cl（pH7.5）,15mmol/LNaCl缓冲液中，水浴煮沸15min,冷却，－20℃保存。

五、实验步骤

1.PCR产物的连接

于冰水浴中配制如下反应体系。

总体积

10.0μL

T4DNA10×

ligBuffer

1.0μL

pGEM®

-TEasyVector

PCR产物

3.0μL

T4DNA连接酶

ddH2O

4.0μL

用移液枪吹打连接反应使之混匀后，4℃孵育过夜。

2.连接产物转化大肠杆菌

（1）将-80℃保存的DH5α感受态细胞置于冰中溶解10min。

（2）取100μL感受态细胞至新的1.5mL离心管中。

（3）向感受态细胞中加入0.1ng-10ng（约7ul）转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30min。

（3）42℃水浴锅中放置45s后，立即冰中放置2min。

（4）加入890μL37℃预温的LB培养基。

（5）37℃,200rpm振荡培养1h，4000×

g，室温离心1min。

（6）倒掉上清，向沉淀中加入100μLLB液体培养基后充分混匀，取30μL悬浮菌液涂布于LB抗性平板（2%X-Gal：

40μL；

24mg/mLIPTG：

7μL；

100mg/mLAmp：

30μL）。

（5）37℃下倒置培养12-16h，挑选白色单菌落扩增培养。

3.质粒DNA的提取

（1）将含有目的基因的阳性克隆菌落从LB抗性平板上接种到5mL含有Amp的LB液体培养基中，37℃,200rpm，过夜摇菌。

（2）取1.5-5.0mL菌液至1.5mL离心管中，10,000×

g，4℃，离心1min，倒掉上清液。

重复操作一次。

（3）向沉淀中加入150μL的SolutionⅠ，涡旋震荡，直至没有沉淀。

（4）加入200μLSolutionⅡ，轻柔的上下翻转离心管数次，使之混匀，冰中放置3min（加入SolutionⅡ后在冰上放置不要超过5min）。

（5）加入150μLSolutionⅢ后立刻混匀，冰中放置3min。

（6）10,000rpm，4℃，离心10min，将上清液转移到另一离心管中。

（7）加入2倍体积的无水乙醇（约700μL），颠倒离心管数次以混合，-20℃放置20min。

（8）10,000rpm，4℃，离心10min，弃上清液。

（9）加入1mL70%乙醇洗涤DNA沉淀。

（10）去掉上清液，倒扣于吸水纸上几分钟，在空气中使沉淀干燥或真空抽干，干燥的标志为白色沉淀变为半透明或透明。

（11）加入18μLddH2O溶解沉淀，加2μLRNase（100μg/mL），使RNA酶终浓度为20μg/mg，振荡，37℃度保温40分钟。

（12）-20℃保存备用。

4.质粒DNA的酶切

（1）于冰水浴中配置如下反应体系。

ddH2O

7.9μL

10×

HBuffer

质粒

0.6μL

EcoRI

0.5μL

（2）用移液枪吹打反应体系使之混匀后，37℃反应30min。

（3）电泳检测

六、实验结果分析：

本实验中连接形成的重组质粒具有Amp抗性，转化细胞可在相应培养基中形成菌落，在IPTG和X-Gal作用下形成蓝白斑。

转化大肠杆菌铺板后12-16h观察抗性菌落及蓝白斑。

附照片。

提取的质粒，利用限制性内切酶EcoRI进行酶切，可将目的基因切下。

酶切情况通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，照相。

七、注意事项：

1.实验中所有酶均需于冰上操作。

2.严格按照规定使用酶的用量

3.电泳时注意自身防护，切勿手触试剂

4.大肠杆菌感受态一定放冰上进行实验操作。

5.热激和冰浴时间要准确。

实验二农杆菌介导的烟草遗传转化

一、实验原理

根癌农杆菌携带的Ti质粒T－DNA区片断能在诱导物的作用下进入植物细胞并整合到植物核基因组中。

由于植物细胞的全能性，在无性繁殖的过程中，携带外源基因片断（T-DNA片断）的植物细胞经诱导培养再生后得到完整的转基因植株。

植物材料

烟草Nicotianatabacumcv.K326

农杆菌

根癌农杆菌EHA105

培养基

共培培养基：

MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+3%sucrose+0.7%agarpH5.80

筛选培养基：

MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+3%sucrose+0.7%agar+100mg/LTemetin+100mg/LKmpH5.80

生根培养基：

MS+sucrose2%+0.75%agar+100mg/LTemetin+100mg/LKm

YEP培养基：

10g/Lpeptone，10g/LYeastExtract及5g/LNaCl。

pH:

7.20

重悬液:

MSpH5.80

实验仪器：

超净工作台摇床离心机

三、实验步骤

烟草叶片材料的准备

烟草叶片经75%酒精消毒30s，0.1%升汞消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次后，取消毒后的烟草叶片，切去叶片边缘,再将叶片切成约0.5cm*0.5cm见方的叶盘。

农杆菌的培养及活化

1.用接种针蘸取-80℃冻存的农杆菌在YEP（20mg/Lrif，50mg/Lkm，1.5%agar）固体培养基上活化，28℃恒温培养24小时左右，直到长出合适大小的菌斑。

2.用牙签挑取农杆菌单菌落放入5mlYEP（20mg/Lrif，50mg/Lkm）培养基中，200rpm28℃震荡培养24小时左右。

3.于5ml菌液中取500-1000ul加入到50mlYEP培养基中，200rpm28℃振荡培养，至OD600值达到0.4-0.7。

将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm，4℃离心10min，收集菌体。

遗传转化

1.用MS重悬液重悬农杆菌菌液，调节OD600为0.3～0.4。

2.将烟草叶片放入重悬菌液中，浸泡6min。

3.将侵染过的烟草叶片，用滤纸蘸干，紧密排列于共培养基中；

25-26℃黑暗条件下共培养三天。

4.将共培养3天的烟草叶片，转接于筛选培养基中。

5.10d继代一次，4周后即有愈伤组织的形成和芽的分化。

6.待筛选后的绿芽长到2cm高左右时，切下绿芽转入生根培养基。

7.待抗性苗长至8-10cm时，炼苗移栽至花盆中，继续培养，直至收获种子。

四、实验结果分析：

1.烟草叶片在筛选培养基上培养4d后，观察材料的污染情况；

2．烟草叶片在筛选培养基上培养21d后，观察材料的愈伤诱导及芽诱导情况，并统计出芽率。

出芽率=诱导出芽外植体数/接种外植体数；

（留出位置附照片）

五、注意事项：

1.留出一部分叶盘做对照，暗处共培养3d。

2.叶盘要放平，使其边缘与培养基充分接触，保证未转化的细胞处于选择压力下。

3.爱护实验室仪器以及药品，实验时不要大声喧哗，保持安静。

4.酒精灯、锋利刀片要正确使用，注意安全。

实验三转基因植物表型观察、GUS（β-葡萄糖醛酸糖苷酶）表达活性分析及鉴定

BAS1基因是调控油菜素内酯分解代谢的基因，该基因能使油菜素内酯活性降低，从而影响转基因植株的生长发育。

GUS基因是转基因植物使用较多的一种报告基因，具有检测快速简洁高效的特点。

GUS组织化学法染色原理为：

适宜的反应条件下（一般37℃），取实验材料、加入GUS酶的将底物X-Gluc（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），在酶的活性部位产生沉淀，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。

PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在95°

高温时变性会变成单链，低温（一般是60°

C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°

C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'

-3'

）的方向合成互补链。

利用BAS1基因的引物扩增植株基因组DNA，从而鉴定是否为转基因植株。

1.植物材料

转BAS1基因烟草叶片（实验室提供）

2.试剂

（1）10×

Buffer（10ml）

1MTris（pH7.5）10ml

Nacl290mg

K3Fe（CN）666mg

（2）规划实施中所采取的预防或者减轻不良环境影响的对策和措施有效性的分析和评估；

（2）染液（10ml）

10×

Buffer1ml

Methanol（甲醇）2ml

D.可能造成轻度环境影响、不需要进行环境影响评价的建设项目，应当填报环境影响登记表X-Gluc5mg

Water7ml

三、实验仪器

（3）评价单元划分应考虑安全预评价的特点，以自然条件、基本工艺条件、危险、有害因素分布及状况便于实施评价为原则进行。

注射器、37℃恒温箱等

四、实验步骤

（3）旅行费用法1.表型观察

观察转基因烟草与非转基因烟草形态等差异变化。

2.GUS染色

（1）取转BAS1基因烟草叶片徒手切成细丝后放入置于PCR管中，用注射器反复抽真空5-6次；

（2）加入GUS染液10µ

l，置37℃恒温培养箱放置0.5-3h或者放置过夜反应；

6.提出安全对策措施建议（3）吸取染液，依次分别加入各1mL20％、50％、70％、100％乙醇脱色，每次脱色0.5-1h，直至叶绿素消失，拍照观察。

3.PCR鉴定

环境影响的经济损益分析，也称环境影响的经济评价，即估算某一项目、规划或政策所引起的环境影响的经济价值，并将环境影响的经济价值纳入项目、规划或政策的经济费用效益分析中去，以判断这些环境影响对该项目：

规划或政策的可行性会产生多大的影响。

对负面的环境影响估算出的是环境费用，对正面的环境影响估算出的是环境效益。

基因组DNA提取CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法HexadecyltrimethyAmmoniumBromide）

A、试剂

『正确答案』A2×

CTAB提取缓冲液：

2g/100mlCTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris∙Cl（pH8.0）

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）

（1）非煤矿矿山的建设项目（注：

对煤矿建设项目有单独特别规定）；

B、操作

（3）环境影响技术评估。

（1）2mL离心管中加入0.5mLCTAB提取缓冲液，65℃预热。

（2）取0.1-0.2g新鲜幼嫩叶片，去除叶脉，置于研磨中，加入液氮（研磨过程中加入0.01gPVP及少许石英砂）迅速研磨成粉；

　　（3）将冻粉迅速转入盛有提取缓冲液中，涡漩振荡器上1min，于65℃水浴保温30-60min。

其间晃动2~3次。

（5）阐述划分评价单元的原则、分析过程等。

　　（4）取出离心管，冷却至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:

1），轻缓颠倒混匀2-3次，室温放置10min。

　　（5）10000r/min离心10min。

转移上清液于另一离心管中，加入2/3倍体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15min。

　　（6）10000r/min室温离心10min，去上清液。

自然干燥后溶于50~100uLTE中备用。

（7）DNA浓质量检测

定量检测：

测OD260，样品DNA浓度=50μg/mlxA260x稀释倍数。

定性检测：

用0.5%琼脂糖凝胶，电压100V，电泳时间30min。

PCR反应

（1）反应体系：

组分

体积

模板DNA

1uL

PCR缓冲液

2.5uL

10mMdNTPMix

0.5uL

Platinum@TaqDNA聚合酶

0.1uL

50mMMgCl2

0.75uL

引物1

0.5uL

引物2

灭菌蒸馏水

19.15uL

模板DNA使用转基因烟草DNA、非转基因烟草的DNA及含BAS1基因质粒。

（2）反应条件：

95℃，5min；

94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；

72℃7min；

4℃保温。

BAS1基因的片段大小约为300bp。

用1%琼脂糖凝胶，电压80V，电泳时间45min。

五、实验结果分析：

1．转BAS1基因烟草植株表型观察

转BAS1基因植株的形态学描述，转基因植株与对照植株进行形态学的比较。

2．转BAS1基因烟草植株的GUS染色分析（附每组的染色照片）

3．PCR鉴定结果（附照片）

六、注意事项

1.应同时对未转化的植株作为对照，以尽可能消除本底对染色的影响。

2.加入染液后，保证样品全部侵入溶液中，颠倒混合数次，盖好盖子防止挥发。

3.爱护实验室仪器和药品，实验时不要大声喧哗，保持安静。

4.不得裸眼观察紫外拍照。