microRNA 技术Word格式.docx

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并且在多种病理状态下，miRNA呈现异常表达，这些异常表达miRNA在疾病发生、发展和转归中发挥了重要作用，当前，基于miRNA的治疗方式研究当前正在进行中。

miRNA的发现历史

miRNA是由VictorAmbros,RosalindLee和RhondaFeinbaum等人在研究lin-14基因在调节线虫发育中作用时发现的。

他们发现LIN-14蛋白丰度受到一个由lin-4编码的短RNA产物的调节，来自lin-4基因的61个核苷酸前体生成一个22个核苷酸的RNA，该RNA含有与lin-14mRNA3’UTR部分互补的序列。

这种互补特性为抑制lin-14翻译生成LIN-14蛋白的充分必要元件。

然而在当时，lin-4却被认为是线虫中特有的现象而被忽视。

直到2000年，第二个小rnalet-7被发现，let-7可以抑制lin-41,lin-14,lin-28,lin-42和daf-12等在发育转型中发挥重要作用基因的翻译。

很快又发现let-7在多个物种间保守存在，表明在更广泛的生物物种中存在这种调节。

miRNA的命名术语

当前，发展了一套标准的miRNA命名系统，前缀mir后紧跟“-”和相应数字，数字通常显示名字的先后次序。

而小写的mir-指pre-miRNA，如果使用大写的miR-则指成熟的miRNA。

对于差别只有一到两个核苷酸的近似相同的miRNA，在命名时通常另外添加一个小写字母，例如miR-200a和miR-200b。

为了区分物种来源，通常在miRNA的前面加上三个字母组成的前缀，如人源性的使用has，而绵羊（Ovisaries）来源的使用oar，其他如v表示来自病毒基因组，D表示果蝇源性的等。

如果定位于不同基因组位置的前体miRNA可以生成完全一致的成熟miRNA，则通常使用外加的“-”加数字后缀来区别这种情况，例如hsa-mir-194-1和hsa-mir-194-2位于基因组的不同位置，而剪切生成相同的成熟miRNA序列hsa-miR-194。

当两个成熟的miRNA来自于相同的前体miRNA的相反的两个臂，则使用“-3p”和“-5p”后缀（过去曾使用s和as表示，分别来自sense和antisense）。

当相对表达水平已知时，通常使用星号表示该miRNA在表达水平上较其对应的反向臂miRNA低。

例如miR-31和miR-31*分别来自于同一前体miRNA的两对应臂，且miR-31为主要存在形式。

miRNA的生物起源

约40%的miRNA基因位于蛋白的内含子中或是不编码蛋白的基因序列中，甚至位于外显子中。

虽有例外，它们通常呈正向分布。

因此，它们多数与其宿主基因一起受到调节。

另有42-48%miRNA基因呈多顺反子形式排布，虽然这并不表示这成簇分布的miRNA在结构和功能上存在相似性，但它们共用一个启动子区域，由2-7个不同的环结构经剪切加工而来。

其启动子在模序结构上与由RNA聚合酶II转录的其它启动子，如编码功能蛋白基因的启动子相似。

DNA模版并不是成熟miRNA的最终形式，部分人类miRNA存在RNA剪辑，位点特异的RNA序列修饰导致其产物和DNA模版不一致，从而增加了miRNA的多样性，超出了基因组模版的数量范围。

miRNA的转录

miRNA通常由RNA聚合酶II（PolII）转录生成。

PolII结合在以后形成发夹结构的颈环DNA序列附近。

生成的转录本经修饰添加5’帽子结构和3’末端多腺苷酸尾巴结构，并剪切，生成的产物称为初级miRNA（pri-miRNA），该产物可能长达数千或数百核苷酸，可能包含多个miRNA环结构。

RNA聚合酶III（PolIII）转录生成部分miRNA，尤其是上游为Alu序列，tRNAs和哺乳动物广泛散步重复（mammalianwideinterspersedrepeat（MWIR））启动子单元的miRNA。

miRNA的核内处理过程

单个pri-miRNA可能含一到六个miRNA前体。

这些发夹结构每个由约70nt左右的核苷酸组成。

每个发卡结构附以部分序列以利于有效剪切处理。

pri-miRNA中的双链发夹RNA结构被叫做DGCR8的核蛋白（DiGeorgeSyndromeCriticalRegion8，该蛋白与DiGeorge综合症关系密切，在非脊椎动物中称为"

Pasha"

）辨认，DGCR8同Drosha酶一起形成微处理（microprocessor）复合体。

在该复合体中，DGCR8组织Drosha蛋白的RNaseIII结构域使其在距离发卡结构约11个核苷酸处切割pri-miRNA，使其释放发卡结构。

释放的发卡结构即为前miRNA（pre-miRNA）,pre-miRNA在3’存在两个悬空的核苷酸，pre-miRNA5’为磷酸集团，3’为羟基集团。

在果蝇和线虫中存在由内含子直接剪切产生的pre-miRNA，并不经过微处理复合体过程，这种miRNA称为mirtrons。

部分pre-miRNA可发生核RNA剪辑。

多数情况下，作用于RNA的腺苷酸脱胺酶（adenosinedeaminasesactingonRNA,ADAR）催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷（inosine），RNA剪辑能够阻碍核内处理过程（例如导致pri-miR-142被核糖体酶Tudor-SN降解），并改变下游处理过程，包括在胞浆的miRNA处理和靶向特异性（如在中枢神经系统中改变miR-376种子区序列）。

miRNA的细胞核输出

Pre-miRNA发卡通过Exportin-5蛋白的核胞浆穿梭完成从核输出到胞浆过程。

Exportin-5蛋白为karyopherin家族蛋白成员，该蛋白通过辨认DroshaRNaseIII酶切割留下来的3’两个悬空的核苷酸，介导pre-miRNA的输出，该过程由GTP提供能量完成。

miRNA的胞浆处理过程

在胞浆中，pre-miRNA发夹结构经RNaseIIIDicer切割处理。

这种内源性核糖核酸酶（endoribonuclease）与发夹结构的3’相互作用并在环的3’和5’臂上完成切割，产生长约22nt并不完美匹配的miRNA:

miRNA*双链结构。

不但发夹结构和颈环的大小影响了Dicer酶切割效率，miRNA:

miRNA*双链结构的不完全匹配特性也影响了Dicer酶的切割效率。

虽然双链结构中的任何一条都可能成为功能miRNA，但是通常只一链可能进入RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），在RISC中与其相应靶基因mRNA发生相互作用。

miRNA在植物中的生成情况（Biogenesis）

miRNA在植物中的生成过程与在后生动物中不同，区别主要在核处理和输出过程上。

与后生动物在核和胞浆中由两种不同的酶切割不同，在植物中，由Dicer酶的同源基因Dicer样酶1（Dicer-like1,DL1）完成切割处理过程。

DL1只在植物细胞核中表达，表明两种反应都发生在核内。

植物miRNA:

miRNA*双链结构转运出核前，其3’突出序列经RNA甲基化转移蛋白Hua-Enhancer1（HEN1）甲基化修饰。

而后此双链结构被Hasty（HST）由核输出至胞浆，在胞浆中解离生成成熟的miRNA，进入RISC。

Hasty蛋白即为后生动物中Exportin5蛋白的同源蛋白。

RNA诱导的沉默复合体

RNA诱导的沉默复合体（RISC）除了包括成熟的miRNA外，还包含Dicer蛋白和多种其它相关蛋白。

RISC也被称为microRNA核酸蛋白复合体（microRNAribonucleoproteincomplex,miRNP），掺入RISC的miRNA也被称为miRISC。

现在认为Dicer对pre-miRNA的处理与双链螺旋的解旋是偶联在一起的。

通常情况下只有一条链进入miRISC，对双链中某一条链的偏好选择基于相对另一条链的热动力学不稳定性和更差的碱基配对能力。

颈环的位置可能也影响了掺入链的选择性。

不进入RISC的链被称为passenger链，其miRNA被冠以星号（*），具有更低的稳定性，通常情况下被降解掉。

在某些情况下，两条链都具有活性，成为针对不同靶基因mRNA的功能miRNA。

Argonaute（Ago）蛋白成员在RISC功能中处于中心地位，该类蛋白为miRNA诱导的基因沉默的必需组分，其含有两个保守的RNA结合结构域。

PAZ结构域结合成熟miRNA的3’序列，PIWI结构域组装核酶H（ribonuclease-H），并与导引链（miRNA）5’端结合。

Ago蛋白与成熟miRNA结合使其正确朝向，以便对靶基因mRNA完成切割。

一些Ago蛋白，例如人Ago2，直接切割靶转录本;

另外，Ago蛋白也可能招募其它蛋白行使翻译抑制功能。

在人类基因组中含有8个Argonaute蛋白，根据序列相似性分为两个家族：

AGO和PIWI。

AGO蛋白有4个成员，存在于所有哺乳动物细胞中，在人类这类蛋白称为E1F2C/hAgo;

PIWI存在于精细胞和造血干细胞中。

RISC的其它组成成分还包括TRBP[humanimmunodeficiencyvirus（HIV）transactivatingresponseRNA（TAR）bindingprotein]，PACT（proteinactivatoroftheinterferoninducedproteinkinase（PACT）,SMN复合体，脆性X智障蛋白（fragileXmentalretardationprotein，FMRP）和Tudor-SN（Tudorstaphylococcalnuclease-domain-containingprotein）等。

miRNA介导的基因沉默模式

miRNA与靶mRNA的典型作用方式主要有两种。

在大多数情况下，复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3’UTR不完全互补配对，阻断靶基因的翻译，从而调节基因表达。

这种方式主要影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。

近来，有研究对翻译抑制理论提出质疑，发现被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞浆中被称为P小体（processingbodies，P-bodies）的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。

P小体可能是作为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器，减少一些特定P小体组成蛋白的表达能够缓和miRNA介导的基因表达抑制作用。

P小体是胞浆中的一定区域，它包含参与多种转录后过程的蛋白质，例如：

mRNA降解（mRNAdegradation）、无义介导mRNA衰退（nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD），转录抑制及RNA介导的基因沉默（RNA-mediatedgenesilencing）。

另一种作用方式与siRNA类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白通过切割mRNA直接导致其降解，实现基因沉默。

以siRNA参与的RNAi为例：

siRNA可与RISC结合，作为模板识别mRNA靶子，通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。

双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22nt左右的siRNA，siRNA继续同RISC形成复合体，与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。

这个过程也称为转录后基因沉默（PTGS）。

总之，当前认为miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关。

miRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达发挥作用;

miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。

另外，miRNAs有时候也导致组氨酸修饰和启动子区的DNA甲基化，从而影响靶基因的表达。

除此外，近来发现快速脱腺苷酸化（accelerateddeadenylation）是miRNA抑制基因表达的新机制。

在哺乳动物细胞中发现miR-125b和let-7能够促进mRNA聚腺苷酸尾巴（polyAtail）的去除。

用3’组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴，不但可以消除miR-125b对mRNA含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用，可见miRNA能通过降低翻译效率和聚腺苷酸化mRNA的浓度来抑制基因表达。

miRNA的翻译起始抑制

目前对miRNA翻译起始抑制机制主要有如下几种观点：

认为miRNA可能通过抑制全能性核糖体的组装而阻断翻译起始。

EIF6是一种可以抑制核糖体40S和60S亚基结合、阻断80S全能性核糖体形成的蛋白，EIF6与Ago/RISC直接相互作用，并且在哺乳动物和线虫中，缺失EIF6影响miRNA介导基因沉默。

然而，RISC是否通过与EIF6相互作用诱导40S和60S核糖体解聚还有待于进一步的研究。

第二种观点根据miRNA抑制要求靶mRNAm7G帽子的存在，认为miRISC可能抑制翻译起始复合物的形成。

研究发现，增加体外系统中eIF4F复合物（含有m7G帽子结合蛋白、翻译起始因子eIF4E）水平可回复miRNA翻译抑制;

另一个研究发现，Ago2中间结构域具有结合m7G帽子的活性，Ago2经miRNA招募到靶mRNA3’UTR，与起始复合物eIF4E/G竞争性结合m7G帽子，抑制翻译起始复合物的形成。

第三种观点认为miRNA可能通过阻止polyA结合蛋白polyAbindingprotein（PABP）与mRNA结合影响翻译起始。

miRNA引起靶mRNA脱腺嘌呤反应，导致RNA的polyA尾巴缩短，使PABP结合mRNA受阻，从而影响翻译起始。

miRNA翻译起始后抑制

研究发现一些被miRNA抑制的mRNA与翻译活跃的多核糖体偶联，说明这些miRNA的抑制作用不是发生在翻译起始水平。

此外，经内部核糖体进入位点（InternalRibosomeEntrySite,IRES）起始、不依赖于mRNAm7G帽子的翻译过程也可以被miRNA抑制，证明miRNA抑制发生在翻译起始之后。

虽然有如上证据，但是关于miRNA究竟如何在翻译起始后发挥抑制作用，目前还没有一致的结论。

有研究者推测miRNA可能引起新生多肽链的翻译同步降解，或者是在翻译延伸过程中，miRNA能引发翻译提前终止。

miRNA介导mRNA衰减

miRNA可以诱导与之不完全配对靶mRNA衰减，下调靶mRNA的水平。

发现Ago蛋白定位于降解mRNA的RNA颗粒（RNAgranules），如P小体中，这些RNA颗粒中包含mRNA降解酶，提示这些mRNA降解酶可能参与miRNA介导的mRNA衰减。

此外，miRISC的核心成分Ago家族蛋白有多种异构体，其中一些成员的内切酶活性也可能协助miRNA介导的mRNA切割或衰减。

这些证据支持miRNA可以直接或间接介导靶mRNA的降解。

RNA颗粒扣押、降解或储存靶mRNA

胞浆的RNA颗粒，如P小体和SG（StressGranules）颗粒，是细胞储存处于翻译抑制状态mRNA的场所，在此，mRNA被降解或/和释放重新进入翻译机器，在转录后水平的基因表达调控中具有重要的作用。

P小体被认为是细胞mRNA代谢场所;

SG颗粒因特异性地在受胁迫条件下形成而得名，P小体和SG颗粒可能是miRNA胞内发挥作用的重要场所：

在miRNA存在下，miRISC中的核心组分及与miRISC结合的mRNA定位于P小体和SG颗粒中;

抑制P小体的形成可抑制miRNA介导的翻译抑制，抑制RISC也同样抑制P小体的形成。

推测被miRISC结合的mRNA进入P小体和SG颗粒中，RNA颗粒的翻译抑制子使mRNA处于翻译抑制状态，从而实现基因沉默，靶mRNA被扣押后随即进行一个mRNA衰减或储存的分拣步骤，P小体和SG颗粒可能分工执行mRNA降解和暂时储存功能。

miRNA正调控和去抑制

最近的研究发现了一些新型的miRNA作用方式，如miRNA正调控和去抑制作用等。

miRNA不总是基因表达的负调控因子，在一些条件下，miRNA上调基因表达。

在细胞周期过程中，miRNA效应在抑制和活化作用间摆动，在G0期细胞中，miRNA活化翻译上调基因表达，而在其它时期发挥抑制作用。

另外还发现一些增殖细胞中表达的mRNA3’UTR保守性地缩短，导致miRNA的靶位点减少，从而避免miRNA负调控作用。

miRNA的周期（turnover）

miRNA需要快速实现周期轮转以满足miRNA表达谱快速改变的需求。

当miRNA在胞浆中成熟时，Argonaute蛋白结合miRNA过程普遍被认为具有稳定引导链的作用，而同时互补的passenger链被降解消除。

argonaute蛋白倾向于保留下可以调控大量靶基因的miRNAs，而清除靶向基因较少和没有任何靶基因的miRNA。

在动物中，成熟miRNA的衰减由5’-3’外切核酸酶XRB2（又称为Rat1p）负责，在植物体内由SDN（smallRNAdegradingnuclease）家族成员来执行此功能，但方向相反（3'

-5'

），在动物基因组内也编码与植物SDN酶相似的酶，但其作用还不清楚。

在多种模式生物（包括拟南芥）的研究均表明miRNA的多种个修饰影响miRNA的稳定性，植物成熟的miRNA可通过3’的甲基化增强miRNA的稳定性。

而2'

-O甲基化阻止尿苷酰转移酶在此位添加尿嘧啶（该位点的尿嘧啶化和miRNA的降解有关），同时，有观点认为尿嘧啶化具有保护miRNA的作用，因此，当前对该种修饰的确切作用还没有定论。

尿嘧啶修饰不止在植物，在动物中也存在。

植物和动物miRNA都可以在3’发生腺苷酸修饰，例如肝脏高丰量表达miRNAmiR-122，miR-122在丙型肝炎中具有重要作用，miR-122的腺苷酸修饰具有稳定miRNA的作用，在植物中的研究也发现腺苷酸修饰可以延缓miRNA的降解速率。

miRNA的演化历程（进化）

miRNA因其低的进化率成为重要的分类学标志物。

miRNA的起源与形态进化有关，使基因表达调节更精细，更具有特异性，更有利于复杂器官的生成，并可能最终导致复杂生命的出现。

事实上，形态学进化上的大爆发通常伴随了miRNA的激增。

miRNA通常起源于位于DNA非编码区域随机生成的发夹结构（常位于内含子和基因间），部分miRNA源于已存在miRNA的复制和修饰。

最近起源的miRNA进化的速度（如核酸置换）与其它非编码DNA相当，暗示其通过中性漂变进化;

起源古老miRNA均有很低的进化速度，通常每百万年一个碱基置换的速率都不到，表明miRNA取得一项功能经历了极其精准的选择过程。

在这种情景下，miRNA很难在基因组中丢失。

而最近起源的miRNA，通常可能没有重要的功能，也更容易在进化中丢失。

这种特性使miRNA在进化学上成为杰出的分子标志物，可能有利于解决在分类学上存在争议的类群（如节肢动物）。

miRNA是在多数真核生物中普遍存在的特性，从褐藻到后生动物都存在。

到2011年3月止，已经在各个物种界共发现了15170多miRNA。

虽然在细菌中没有发现miRNA，但是在细菌中同样存在短的RNA序列（通常50到数百个核苷酸长），发挥了与miRNA相类似的功能。

miRNA的识别和预测

miRNA具有独特的结构和生物特性：

包括miRNA前体具有发夹或折叠的二级结构，不含有大的内部环状结构和突起，成熟的miRNA位于发夹结构的颈部，由Dicer加工而成，成熟miRNA长约22nt左右，其序列在不同物种间保守等。

现今有多种发现miRNA的技术，可分为计算机软件预测和分子生物学实验方法两类。

计算机分析法

利用miRNA结构和构相特征预测基因组中可能存在的miRNA，然后在此基础上通过实验方法证实。

随着不同生物基因组测序的完成和对miRNA结构和生化特征的深入认识，利用计算机程序对基因序列进行搜索大大提高了miRNA的鉴定效率。

人们设计了多种miRNA预测软件，包括miRseeker，snarloop，MirScan等。

计算机预测法的主要依据包括以下三个方面：

首先，发夹结构是miRNA二级结构的基本特性，几乎所有的预测程序均将这一特征作为预测的首要标准;

其次，miRNA序列和结构的保守性，这是区分miRNA候选基因和其它不相关发夹结构序列关键因素;

最后，发夹结构的动力学稳定性和序列、结构的相似性等。

各种预测软件在预测依据上各有侧重。

MiRscan软件就是利用预测序列与已知miRNA的相似性来鉴定潜在miRNA，并对保守发夹结构进行分类，预测了多个C.elegans和人的新候选miRNAs，且通过实验得到确认。

其次是根据靶标序列的保守性进行预测，靶标的3’UTRs都存在保守序列，而且这些保守序列能与miRNAsseed序列互补配对。

最后，根据二级结构的热力学稳定性进行预测，利用这一特性能区别miRNAs和其它具有发夹结构的序列。

miRNAs折叠的自由能比tRNAS和rRNAs低。

RNAz软件为一款结合二级结构的热力学稳定性和序列保守性开发的miRNA预测软件。

很多miRNAs以多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，因此利用已知miRNAs基因附近的序列来寻找潜在的miRNAs基因也是一个很有效的方法。

但是，软件分析法存在一个明显的缺陷：

目前对miRNAs的认识还不足以到使用计算机