热休克蛋白HSP构建纳米粒的安全性评价Word格式.docx

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HeatShockProteins（HSPs）;

Safety;

Nanoparticles

纳米技术是近年来发展很快的新型技术，它的基本涵义是在纳米尺寸（0.1~100nm）范围内认识和改造自然，通过直接操作和安排原子、分子创制新物质。

已经广泛应用于材料、制造等各个领域，为人类生活带来了种种变化。

在药剂学领域一般将纳米粒的尺寸界定在1～1000nm[1]，纳米药物主要是将药物的微粒或将药物吸附包裹在载体中，制成纳米尺寸范围的微粒，再以其为基础制成不同种类的剂型。

由于纳米药物制剂具有独特的小尺寸效应和一定的表面效应等特性，因而表现出许多优异的性能和全新的功能，其将使药物的生产实现低成本、高效率、自动化、大规模；

纳米制剂药物有着溶解度增大、口服药物吸收良好，生物利用度增强、药物靶向作用等特点，在临床使用中有着广泛的应用前景。

一些生物大分子如普鲁兰糖，由于其水溶性极好，而接枝上胆甾醇后能够在水中自组装成CHP凝胶纳米粒，从而改善使其更易吸收，提高人体生物安全性。

在机械和电子磁性方面有极大优越性的碳纳米管，具有广泛的商业价值。

阿霉素（一种抗肿瘤药）的聚氰基丙烯酸酯纳米微粒可以使通过静脉注射后穿过血脑屏障，从而抑制老鼠脑部肿瘤的增长，具有很好的药性。

此外，一些纳米粒在化妆品行业、防晒（TiO2、Fe2O3、ZnO）、补牙剂（SiO2）、水过滤、催化等领域也得到广泛使用[2,3]。

但是由于纳米粒子特殊的结构及尺寸，往往由于其表面效应和量子效应而表现出不同的物理、化学和生物效应，主要表现在：

1.与常规物质比较更容易透过血脑屏障、胎盘屏障等，也易透过生物膜进入细胞；

2.纳米物质的比表面积大，毒性作用方式更加多样化，从而表现出与非纳米粒子不同的毒性特点。

应用广泛的碳纳米管由于其重量较轻，极易被小鼠吸入肺部，产生肺部毒性，实验表明，严重时小鼠还会出现外周气管炎和坏疽[4,5]。

一些纳米材料如C60由于其可能成为亲水材料，在水中形成胶体样物质，因而会产生环境污染。

实验表明TiO2、CuO和ZnO纳米粒会通过消化道进入小鼠体内，在其肝脏、肾脏以及脾脏中沉积造成损伤[6-8]。

另外Kreuter[9]发现，静脉注射聚山梨酯80包裹的阿霉素纳米颗粒可以通过大鼠血脑屏障，产生一定毒性。

因此，评价纳米粒子的毒性是非常有必要的。

热休克蛋白HeatShockProteins（HSPs）是天然生物超分子材料中的一种，其与白蛋白、铁蛋白均具有极好的生物相容性，其中热休克蛋白由于其独特的球形笼状空心结构，得到科学家的广泛关注，并将其应用于纳米给药系统。

它是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应激蛋白质。

当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。

许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。

HSP在生物界中的一个重要特点是它们在进化过程中的高度保守性。

例如。

从大肠杆菌、酵母、果蝇和人体分离的分子量为70kD的HSP，如果对它们进行全氨基酸序列分析，就可发现它们具有80%以上的相似性。

HSP在进化过程中的高度保守性，说明它们具有普遍存在的重要生理功能。

按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白smallHeatShockProteins（sHSPs）（Kyeongetal.,1998）。

本实验所要用的热休克蛋白的粒径为十几纳米，一用由24个亚基组成，通过亚基的解离和重组包载药物，通过相应的修饰将药物的特异性输送到指定部位，而减少对正常组织的损伤。

HSP作为生物高分子载体蛋白具有良好的生物相容性、可降解性以及低毒性的特点。

试验中通过Tat（细胞穿膜肽）修饰、PSPA（PH敏感的PEG长链）修饰，使热休克蛋白纳米粒更加安全。

1.

实验用品

1.1试剂

重组MJ热休克蛋白（HSP，>

85%）

上海生工生物工程公司

Tat肽（103013，>

PSPA（PH敏感的PEG长链）

透析带（MWCO:

1000）

上海源叶生物科技公司

树脂天青（≥90%,40199）

上海阿拉丁试剂公司

二甲基亚砜（DMSO，化学纯，120425）

西陇化工公司

不完全DMEM（高糖）培养基

南京凯基生物科技公司

胎牛血清（130807）

浙江天杭生物公司

0.25%胰酶（含EDTA）

徐州微科曼得生物工程公司

1.2实验仪器

集热式磁力加热搅拌器（DF-2）

上海浦东物理光学仪器销售部

水循环真空泵（CHZ-CA）

巩义市予华仪器公司

电子天平（CP153）

奥豪斯仪器（上海）公司

电子天平（AB265-S）

梅特勒-托利多仪器（中国）公司

pH计（PB-21）

德国Sartorius公司

荧光分光光度计（F4500）

日本日立公司

紫外-可见分光光度计（UV-2450）

日本岛津公司

冷冻干燥机（FD-1C-50）

北京博医实验仪器公司

恒温振荡箱（SHZ-82）

上海比朗仪器公司

超净台（SW-CJ-1F）

苏净基团苏州安泰空气技术公司

三气培养箱（HF100）

力康发展公司

恒温珠浴锅（74220-714）

美国SHELLAB公司

低速离心机（5702）

德国Eppendorf公司

1.3细胞株和动物

仓鼠肺成纤维细胞（CHL）

中国科学院上海细胞库

普通级兔

徐州医学院实验动物中心

昆明小鼠（体重18g~22g），普通清洁级

（徐州医学院实验动物中心许可证号：

SYXK[苏]2010-0011）

2.实验方法

2.1CHL细胞毒性

仓鼠肺成纤维细胞（CHL）采用含10%胎牛血清，1%双抗的DMEM培养基，在37°

C，5%CO2细胞培养箱中培养。

在显微镜下观察，待瓶中细胞数量为80%~90%时即可进行传代。

首先弃去瓶内培养基，PBS清洗三遍后加入1ml0.25%胰酶消化30s，随后加入等体积完全培养基终止消化。

将细胞转移至离心管中，1500rpm离心3min，弃去上层液体，加入新的培养基轻轻吹打均匀后转移到培养瓶中，继续放回培养箱中培养。

取对数生长期的CHL细胞置于24孔板培养24h，密度1×

105个/孔。

弃掉原有培养基，更换为pH7.4的无血清DMEM培养基。

采用无菌操作，分别将HSP、T-HSP及PT-HSP按照1500μgml-1、750μgml-1、325μgml-1、160μgml-1、80μgml-1、40μgml-1的浓度加入到培养孔中，每个浓度平行3孔。

加完药的24孔板继续放回细胞培养箱内培养24h。

CHL24孔板弃去培养基，用PBS冲洗细胞三遍后，按照100μgml-1加入树脂天青溶液[10]，继续放回细胞培养箱内培养2h，将培养液稀释100倍后用荧光分光光度计测定荧光强度（激发波长：

560nm，发射波长：

585nm，狭缝宽度均为5nm），以不加载体组的荧光强度为对照，计算各组对CHL细胞活性的影响。

2.2急性毒性试验

分别用生理盐水溶解HSP、T-HSP、PT-HSP后，配制浓度为80mgml-1的纳米粒。

昆明小鼠18只，雌雄各半，随机分成三组，给药前禁食12h。

按照2000mgk-1的剂量尾静脉注射，给药体积为0.5ml，2周后观察并记录小鼠毒性反应。

实验结束后处死小鼠，解剖观察脏器变化。

2.3溶血试验

抽取普通级兔新鲜血液15ml，加入适量肝素，1500rpm离心5min，得到红细胞。

用PBS（0.15M,pH7.4）清洗三遍后，弃去上清，配制成2.5%（v/v）的红细胞PBS悬液。

配制20mgml-1的T-HSP与PT-HSP纳米混悬液，分别取0.1ml、0.2ml、0.4ml，用PBS定容至2ml，另取2mlPBS和去离子水，向以上5组各加入2ml红细胞悬液，充分混匀，其中PBS组作为阴性对照组，去离子水组作为阳性对照组。

在恒温振荡箱中37°

C孵育1h，3000rpm离心10min，分别用T-HSP与PT-HSP混悬液作为空白，在541nm处测上清的吸光度，计算溶血率（HemolysisRatio，HR），公式如下：

HR（%）=（OD样-OD阴性对照）×

100%/（OD阳性对照-OD阴性对照）

3.统计学分析

所有实验数据以Mean±

SD表示，利用SPSS13.0进行统计学分析，采用单因素方差分析，P<

0.05认为有显著性差异。

4.试验结果

4.1细胞毒性实验

如图4-1所示，T-HSP的浓度高达1.5mgml-1（远超其使用浓度）时，才对CHL细胞产生一定的影响，可能与其表面接枝Tat的正电荷有关；

而HSP与PT-HSP在高浓度时也没有对CHL细胞活性产生明显影响，表明这三者在正常使用时对CHL细胞不会产生毒性，其中PT-HSP的安全性要优于T-HSP。

表4-1列出了HSP、T-HSP、PT-HSP的荧光强度。

表4-1HSP、T-HSP、PT-HSP的荧光强度

浓度（ugml-1）

HSP

T-HSP

PT-HSP

1500

4674

4659

4488

3672

3482

3890

4574

4670

4690

750

4841

4614

4331

4648

4907

4327

4911

4264

4987

325

5019

4625

4977

4713

4869

4918

4603

5081

160

4938

4814

5101

5096

4822

4975

4761

5075

80

4840

5082

4932

5174

4900

5181

5183

4552

40

5370

5316

5137

5425

5261

5227

空白

5603

5673

5286

图4-1HSP、T-HSP、PT-HSP对CHL细胞的毒性

4.2溶血试验

考察高、中、低三种浓度的体外溶血率，T-HSP分别是4.9±

0.8%，2.6±

0.5%，1.2±

0.7%，PT-HSP分别是1.6±

0.5%，1.2±

0.4%，0.7±

0.2%。

结果显示，静脉注射PT-HSP纳米粒具有较好的安全性。

T-HSP、PT-HSP的平均溶血率%如表4-1所示。

利用溶血率计算公式如：

100%/（OD阳性对照-OD阴性对照）得溶血率。

如下表所示（以Mean±

SD表示）：

表4-1T-HSP、PT-HSP的平均溶血率%

浓度/溶血率

高

中

低

4.9±

0.8%

2.6±

0.5%

1.2±

0.7%

1.6±

0.4%

0.7±

0.2%

溶血率%

图4-2T-HSP、PT-HSP的平均溶血率%

4.3急性毒性试验

急性毒性试验中，以2000mgk-1的剂量尾静脉给予HSP、T-HSP、PT-HSP空白载体，2周内未见小鼠死亡。

观察结束后处死解剖小鼠，未发现主要脏器异常。

5.讨论

安全性实验选用树脂天青进行细胞活性测试，与MTT法相比，结果可靠，稳定性好，且操作简单，检测方便。

急性毒性试验结果表明，小鼠可耐受2000mgk-1的HSP及其衍生物；

根据CFDA《化学药物急性毒性试验技术指导原则》，当给予2000mgk-1剂量未见动物死亡时，可认为该受试物无严重急性毒性中毒的危险性。

材料的血液相容性是其安全性评价的重要组成部分。

溶血试验通过测定红细胞溶解和血红蛋白游离的程度，对生物医药材料的体外溶血性进行评价。

根据国家标准，溶血率小于5%表明生物材料不引起溶血，可安全使用[11]。

PT-HSP由于表面覆盖了一层含有PEG的PSPA包衣，整体呈弱负电性，同时形成了较厚的水化膜，对红细胞膜的干扰较小，因此具有比T-HSP更好的血液相容性。

6.结论

生物安全性评价结果表明，对于CHL细胞，HSP、T-HSP、PT-HSP与对照组相比，细胞毒性无差异，安全性较好；

溶血率低于5%，表明注射PT-HSP不会引起溶血。

急性毒性试验中小鼠尾静脉大剂量注射PT-HSP空白载体无明显毒性，说明PT-HSP采用注射给药具有良好的安全性。

参考文献

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CurrentIssues,2003,66:

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[11]GB/T16886.122001.医疗器械生物学评价第1部分:

评价与试验[S].北京:

中国标准出版社,2002.

致谢

时光荏苒，一晃四年过去了，即将毕业，回首过去四年，心中感慨万分，论文终于完成，顿时感觉如释重负，心中感慨良多。

首先感谢我的指导老师张春平老师和孙晓春对我的帮助，在他们忙碌的中作中抽出时间来指导我撰写，之后又抽时间来审查、修改我的论文，给了我很多建议，帮助我最后完成论文。

还有教过我的所有老师们，你们严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样；

他们循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。

感谢我的师姐，在试验中指导我完成实验，撰写论文时给我建议，给我指出

论文中的问题，教我如何撰写，感谢我的室友们在我孤独无助时给我鼓励，带给我欢乐。

由于我的学术水平有限，所写论文难免有不足之处，恳请各位老师和学友批评和指正！