蛋白质结构与功能的关系Word文档下载推荐.docx

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响尾蛇14

海龟15

金枪鱼21

角饺23

小蝇25

蛾31

小麦35

粗早链孢霉43

酵母44

以人的细胞色素C为标准进行比较，发现人与黑猩猩的细胞色素C的一级结构完全相同，与恒河猴只相差一个残基，与马相差12个残基。

从细胞色素C的一级结构中的氨基酸残基的改变数的多少可以看出，生物从原核到真核，从单细胞生物到多细胞生物，从低等生物到高等生物的进化规律，反映了种属之间的亲缘关系。

2．细胞色素C三级结构活性部位的保守性

　　同源蛋白质：

在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质，指由共同的祖先蛋白分子经过变异和自然选择而产生的功能上相同、相关并在结构上有某种程度相似性的不同蛋白质。

在进化过程中一级结构始终保持不变的氨基酸残基称为守恒氨基酸残基，在不同物种的细胞色素C一级结构中，则有35个位置的氨基酸残基是完全不变的，因此叫做不变残基或叫做守恒残基，这些守恒残基分散在多肽链的各个部位，在分子进化过程中，细胞色素C的一级结构虽然有很大的变化，但三级结构基本上保持不变。

三维结构的关键部位是守恒的，尤其是活性部位的氨基酸残基及其三维排布，均不会发生改变。

这是蛋白质发挥其生物功能的基本条件。

蛋白质分子的三维结构不能因为变异而受到严重影响。

由于分子内部的氨基酸残基通常对维系三维结构比较重要，因此，变异较多地发生在蛋白质分子表面上。

　　血红素是细胞色素C分子的电子传递中心，在生物进化过程中保持不变。

其它不变的氨基酸残基有的是为了保证血红素在蛋白质分子中正确的立体位置，保持多肽的构象形成一个疏水性的狭缝，狭缝的结构严格地决定着整个细胞色素C分子的三维结构，不同物种的细胞色素C的狭缝区域，其疏水性残基一般是保守的，或者是可以保守性取代的残基，脯氨酸在拐角处，甘氨酸没有侧链，体积小，也在拐角处。

　　保守性取代：

指化学性质相似的氨基酸残基之间有相互置换的现象，例如：

Leu与Ile、Phe与Tyr、Asp与Glu之间都能互相替换。

　　Rossman等人研究了各种蛋白质结构与功能的相似性之后指出，在生物进化的过程中，蛋白质的二级结构、超二级结构以及三级结构存在很大的保守性，同源蛋白质的一级结构允许有种属差异，但生物功能所要求的特定构象不能改变。

不同生物的细胞色素C的氨基酸组成是有一些置换，但它们的生理功能却是相同的。

3．系统树：

　　根据蛋白质中氨基酸残基的变化情况与古生物学测定生物进化年代相比较，可以发现各种蛋白质分子进化都有其本身的进化速率，称为单位进化周期。

　　单位进化周期是指蛋白质在进化过程中每一个残基上的变异所需时间。

据此分析出细胞色素C的单位进化周期是2640万年，不同蛋白质的单位进化周期是不同的，血红蛋白仅为580万年。

图3-34生物进化的系统树

　系统树是用计算机分析细胞色素C序列并找出连接分支的最小残基数的方法构建起来的，用其它计算机方法可推断出系统树分支点处的潜在祖先序列。

根据系统树不仅可以研究从单细胞生物到多细胞生物的生物进化过程，还可以粗略估计现存的各类物种的分支时间（图3-34）。

3.2.2肌红蛋白的结构与功能

肌红蛋白的分子结构

肌红蛋白（myoglobin）存在于肌肉中，能贮藏O2，供生物氧化之用。

抹香鲸肌红蛋白是第一个经X-射线晶体衍射测定出精确三维结构的球蛋白，它的分子包括一条153个氨基酸残基组成的多肽链和一个血红素，其多肽链的氨基酸序列。

肌红蛋白多肽链中的残基75~80％处于α-螺旋中，其余为无规卷曲，整个肽链有8个长短不一的螺旋段，即，在侧链基团相互作用下盘曲形成4.3nm×

3.5nm×

2.3nm扁园的球体。

绝大多数亲水残基分布在分子表面，使肌红蛋白可溶于水；

疏水残基则埋藏于分子内部，血红素结合于E与F螺旋之间的裂隙内（图3-35）。

肌红蛋白分子表面有一狭缝，E螺旋和F螺旋位于狭缝两侧，形成一个疏水微环境。

肌红蛋白的辅基血红素就结合在这个狭缝内。

血红素的侧链丙酸基伸到分子表面，在生理pH下，它们带负电荷，Fe2+与卟啉环四个吡咯N原子配位（图3-36A），F8-His残基咪唑环N-3占据第五个配位位置，Fe2+在邻接His（F8）一侧，距离卟啉平面约0.03nm。

O2占据第六配位位置，在卟啉平面另一侧与血红素可逆地结合。

脱氧肌红蛋白中第六配位空置：

而在高铁（Fe3+）肌红蛋白中H2O占据这个位置。

在狭缝另一边E7His并未与血红素结合，称为远侧组氨酸，靠近第六配位位置（图3-36B）。

肌红蛋白由3个外显子编码：

外显子Ⅰ编码1至30（NA1到B2），外显子Ⅱ编码31至105（B3至G6），外显子Ⅲ编码106至153（G7至HC5）（图3-32）。

研究表明，39至139（C4到H14）的片段与血红素结合关系密切。

有人用蛋白酶从脱辅基肌红蛋白N-端和C-端各切去一段，制备出相当于32至139的多肽，加入血红素后构成微型肌红蛋白，在体外系统能可逆地与O2结合，与天然肌红蛋白相似。

就氧合功能而言，1-31和140-153贡献不大，但不排除这些片段在稳定分子结构、促进合成、折叠和运输以及种系发生等方面可能的作用。

图3-37血红蛋白β-亚基的形成

肌红蛋白的功能

血红素在水中可以短暂地氧合，然后形成血红素-O2-血红素夹层中间物，很快产生不能氧合的高铁血红素。

虽然肌红蛋白中真正与O2结合的是血红素，但是肽链起着围篱作用。

由于血红素结合在肽链绕成的疏水狭缝中，远侧His的位阻效应防止了夹层复合物的形成，避免了Fe2+氧化或流失，使血红素可以长时间可逆的氧合-放氧，完成O2载体的使命。

同样是血红素辅基，在细胞色素中它是电子载体，在过氧化氢酶中参与过氧化氢分解为水和氧的催化过程。

可见辅基的功能在一定程度上依赖于它所结合的多肽链提供的微环境。

为了给肌红蛋白肽链的围篱作用提供实验支持，James和Collman合成了围篱铁卟啉复合物，在铁卟啉平面一侧，有一个咪唑衍生物占据Fe2+第五个配位位置，另一侧有疏水侧链基团形成保护O2结合的围篱（图3-38），它对O2的亲和力与肌红蛋白相仿。

CO是许多含碳物质不完全燃烧的产物，也是血红素在体内降解的产物之一。

游离血红素对CO的亲和力比对O2的亲和力大25000倍：

而肌红蛋白对CO的亲和力仅比对O2的亲和力大200倍。

这是因为游离血红素与CO结合时，C-Fe2+键与C≡O键在一条直线上；

而血红素与O2结合时Fe2+-O键与O=O键之间形成121°

的夹角。

在肌红蛋白中，远侧His（E7）的存在对其与CO的结合显然会产生更大的位阻效应，结果大大降低了对CO的亲和力和CO中毒的危险，保证在生理条件下肌红蛋白能有效地履行贮藏和输送O2的功能（图1.37）。

脱氧肌红蛋白中α-螺旋含量约60％，三维结构比较松散，稳定性下降。

与

血红素结合后，构象发生变化，α-螺旋含量恢复至75％，分子结构比较紧凑，稳定性也明显提高。

这说明血红素辅基对肽链折叠也有影响。

3.2.3血红蛋白的结构与功能

血红蛋白（hemoglobin,Hb）存在于脊椎动物红细胞中，是运输O2和CO2的工具。

Hb是第一个得到X-射线衍射结构分析初步结果的蛋白质，还是第一个与生理功能相联系的蛋白质。

从异常血红蛋白一级结构研究中提出了分子病的概念，从Hb与O2结合中发现了协同效应。

从而成为迄今认识蛋白质结构与功能关系最好的范例。

血红蛋白分子结构

血红蛋白由四个亚基组成（α2β2），每个亚基含一条多肽链和1个血红素辅基。

α亚基多肽有141个氨基酸残基，β亚基多肽链有146个氨基酸残基，二者有60个相同，约占42％，其中有23个残基与Mb相同。

Hb的亚基与Mb的氨基酸序列虽有明显不同，但血红素结合部却非常保守，而且它们的二、三级结构也十分相似，仔细对比也有一些差异（表3-5）。

表3-5血红蛋白α-和β-链与肌红蛋白二、三级结构的异同

肽链区段

肌红蛋白（Mb）

α-链（α）

β-链（β）

A螺旋

AB非螺旋

B螺旋

BC螺旋

C螺旋

CD螺旋

D螺旋

E螺旋

EF螺旋

F螺旋

FG螺旋

G螺旋

GH螺旋

H螺旋

HC螺旋

残基总数

α-螺旋

非螺旋

无规卷曲

α-螺旋基（24个残基）

含5个残基

153

=Mb

A16-B1不同

有310螺旋

都不同于Mb

不存在

EF2~5不同于Mb

G1~3为310螺旋

≈Mb

含20个残基

含3个残基

141

少2个残基

CD5~7不同于Mb

E18~20为无规卷曲

（α=β）

GH1~3不同于Mb

146

血红蛋白的四个亚基按四面体排布，亚基间凹凸互补，构成一个6.5×

5.5×

5nm的四面体。

两个α与两个β亚基按双重对称轴排布，沿X或Y轴旋转180°

，外形相似；

沿Y轴两个α与两个β亚基间均有空隙，形成中心空穴（图1.38）。

α1/β1或α

2/β2之间接触面较大，包括G10~H9之间以及B、D螺旋的34个残基，由17~19个氢键将其缔合成稳定的二聚体（α1/β1和α2/β2），不受血红素和O2结合的影响。

α1/β1或α2/β2之间接触面较小，涉及α1的CD和β2的FG非螺区中19个残基，将两个二聚体缔合为四聚体，此种结合易受O2和血红素结合的影响。

脱氧血红蛋白中,亚基间的静电相互作用（图1.39），以及分子中心空穴周围两个β链的N-端-NH3+、Lys-82（EF6）、His-2和His143（HCl）共8个正电荷与空穴中的效应剂分子2，3-二磷酸甘油酸（BPG）之间静电相互作用（图1.40）对稳定脱氧血红蛋白的四级结构发挥着重要作用。

这些静电相互作用在血红蛋白氧合后不复存在。

血红蛋白的变构效应

Mb和Hb均为储藏和运输O2的载体，Mb是单体，Hb为四聚体，在氧分压较低时Mb对O2的亲和力远大于Hb，如以P50表示一半结合部位被O2饱和时的氧分压，Hb的P50=26Torr，Mb的P50=1Torr。

Mb+O2MbO2

设K为MbO2解离常数，则

；

若Y为Mb氧饱和度，则

用pO2代替[O2]，P0代替K，上式改写为：

，是一个典型的双曲线方程

对Hb来说，Hb+nO2Hb（O2）。

，或

取对数，olg

=nlogpO2-nlogP50

上式即Hill方程，是一个直线方程，Y=0.5时n（斜率）值即为Hill系数。

Mb的n=l，Hb的n=2.8，表明Hb与O2结合存在协同效应（或变构效应），即先结合的O2影响同一分子中空闲的O2结合部位对后续O2的亲和力（详见别构酶一节）。

若以纵坐标表示Y，横坐标表示pO2，Mb的氧合曲线为双曲线，Hb的是S型曲线（图1.41）。

Hb的氧合曲线反映了HbO2的解离特征：

即在氧分压较高的区间，只有很少HbO2解离，表现为S型曲线上段：

在氧分压很低时，只剩下不多的HbO2缓慢地解离，表现为S型曲线下段；

只有在S型曲线中段相应的氧分压区间，HbO2随pO2下降快速解离。

如果肺泡中pO2=100Torr，活动肌肉毛细血管中pO2=20Torr，P50=30Torr，n=2.8，在肺泡中Y=0.97，在活动肌肉毛细血管中Y=0.25，二者之差△Y=0.72，即在此条件下血液从肺泡流到活动肌肉中将释放所携带的72％的O2假如没有协同效应，即n=l，其他条件不变，那么Y肺泡=0.77，Y毛细血管=0.41，△Y=0.36，可见在同样条件下协同效应使Hb的O2释放量增加一倍。

实际测算表明，pO2从100降至20Torr，MbO2只释放10％的O2。

显然，血红蛋白适合于从肺泡到组织的O2运输，肌红蛋白则适合于通过组织间液从血液接受O2，将它储藏在细胞内备用。

人体的血红蛋白除HbA（α2β2）外，还有HbA2（α2δ2）和HbF（α2γ2）。

β、γ、δ链的一级结构仅有个别氨基酸不同，二、三级结构十分相似。

成人血液中HbA2仅占2％，HbF不到1％，而胎儿血液中HbF是主要血红蛋白，在足月的新生儿血液中HbF占70—80％。

在生理条件下，HbF对O2的亲和力大于HbA，使得胎儿通过胎盘循环从母体得到O2（图1.42）。

Hb对O2的亲和力对pH和[CO2]的变化敏感，pH值下降时，Hb对氧的亲和力降低，HbO2解离曲线右移，S型渐趋双曲线型。

实际上血液pH变化很小，而[CO2]增大同样导致Hb对O2的亲和力下降。

Hbα链N-端氨基可逆地与CO2结合。

在代谢活跃的组织中，[CO2]增大或pH下降促进HbO2放O2，而O2的释放又促进Hb与CO2结合，这种现象称为Bohr效应（图1.43）。

1967年，ReinholdBenesch和RuthBenesch发现2，3-二磷酸甘油酸（BPG）是血红蛋白的别构效应剂。

在成熟的人红细胞中[Hb]≈[BPG]，每个Hb在其中央空穴结合一分子BPG，通过与周围正电荷集团的相互作用使Hb的四级结构更趋稳定（见图1.39）。

如果没有BPG，Hb的氧合就不存在协同效应，在生理条件下，BPG的结合使Hb对O2的亲和力下降到1/26。

在某些内外因素影响下净输氧量下降时，机体可通过调整BPG浓度进行补偿。

例如肺气肿病人因支气管气流受阻，Hb不能充分氧合，动脉血pO2仅为50Torr，只有正常值的一半。

由于BPG浓度从4.5升至8.0mmol/L，使P50从26升至31Torr，动脉O2饱和度从0.86变到0.82，静脉O2饱和度从0.60变为0.49，因此净输O2量△Y从0.26增至0.33。

又如一个人从海拔0米到海拔4500米时，48小时内他的红细胞中[BPG]从4.0增至7.5mmol/L，净输O2量相应增大（图1.44）。

由于γ亚基HCl是Ser而不是His，不能与BPG形成盐键，致使胎儿血红蛋白HbF（α2γ2）对BPG的结合力小于HbA（α2β2），因此对O2亲和力较高。

血红蛋白别构效应的分子机制

Hbα-亚基的单体具有对O2的高亲和力，氧合曲线为双曲线，与Mb极为相似。

孤立的β亚基易形成四聚体，β4被称为HbH，没有HbA的变构效应。

因此，血红蛋白的别构性质来源于亚基间的相互作用。

（1）氧合中血红素铁原子的变化：

在脱氧血红蛋白中，由于连接血红素F8His咪唑环与血红素卟啉环间的位阻斥力，以及血红素铁外层电子处于高自旋状态，半径较大，不能进入卟啉环中央小孔，而离开卟啉平面约0.06nm：

同时血红素向F8His方向稍微隆起，呈现圆顶形（图1.45）。

在氧合过程中，铁外层电子变成低自旋状态，半径缩小了13％，移动0.06nm，进入卟啉平面中央小孔，血红素完全呈平面状态。

血红素的状态既受O2结合的影响，又依赖于Hb整体的四级结构。

（2）亚基三级结构的变化：

在血红蛋白亚基中，血红素及F8His与邻近的15个侧链基团有紧密的联系。

因此，氧合过程中铁原子的位移牵动F8His位移以及F螺旋、EF和FG片段等的位移（图1.46）。

F螺旋向H螺旋移动二者之间的空隙变小，迫使HC2的Tyr侧链从隙中移开，导致链间盐键的断裂。

这样，血红素上氧合引起的变化，触发亚基内部的构象改变，导致亚基交界面上的结构改变。

（3）四级结构的变化：

氧合引发的构象变化传递到亚基界面上，促使两个原体（α1β1）与（α2β2）相对旋转15°

，平移0.08nm（图1.47）。

脱氧状态时α1亚基C7Tyr-42酚基与β2亚基G1Asp99羧基间的氢键，在氧合引起的亚基位移中被破坏，而在α1亚基G1Asp9的羧基与β2亚基G4Asn102酰胺基间产生一个新的氢键（图1.48）。

氧合过程中亚基的旋转和位移，使维持四级结构的盐键断裂，两个β亚基的铁原子间的距离从3.99减为3.31nm，分子中央空穴变小以致容纳不下BPG，盐键的断裂也引起β亚基的构象改变，如E11Val侧链移开，解除了O2结合的空间位阻。

按照序变模型，上述血红蛋白氧合过程变构效应的机制概括于图1.49。

异常血红蛋白

编码血红蛋白多肽链的基因发生突变，导致个别氨基酸取代、缺失、肽段融合，延长甚至整个肽链的缺失，形成300种以上的异常血红蛋白。

由于取代发生的位置、范围、性质各不相同，对血红蛋白结构和正常功能的影响也就有所不同，有的异常血红蛋白结构和功能均无重大改变，有些异常血红蛋白的结构发生显著变化而导致疾病，因此，对于阐明蛋白质结构与功能的联系极有参考价值。

根据变异的性质，可将异常血红蛋白分为以上四类。

（1）分子表面发生变异的Hb：

分子表面发生取代的异常Hb已发现一百多种，绝大多数不影响Hb的稳定性和功能，在临床上是无害的。

但有少数可引起临床症状，尤其是镰刀状红细胞贫血症，患者红细胞含异常的HbS，红细胞呈镰刀形，易破碎，寿命短，从而导致严重的贫血，甚至危及生命。

现已查明，镰刀状红细胞贫血患者编码珠蛋白β链的基因有一个碱基突变（T→A）结果β6（A3）的Glu被Val取代，致使HbS比HbA少2~4个负电荷，pI从6.68增至6.91，在脱氧状态下溶解度仅为HbA的1/25。

Val取代Glu使HbS每个亚基外侧产生一个粘斑，而脱氧HbS还有与粘斑互的部位，互相粘结，形成细长的脱氧HbS聚合体（图1.50）。

几股这样的聚合体盘旋缠绕，形成在电镜下可见的直径为17nm和21.5nm的两种纤维。

直径21.5nm的螺旋纤维更常见，有14股螺旋纤维。

这些纤维使红细胞变成易碎的镰刀形。

红细胞破碎后释放出HbS纤维，使血液粘度增大，血流不畅，小血管阻塞，造成供O2不足又恶性循环地导致形成更多的镰刀形红细胞。

被释放的HbS随即被降解，以致造成严重的贫血，最后危及生命。

纯合子（HbS/HbS）患者红细胞中HbS含量高达95％以上，多于成年前夭亡；

杂合子（HbS/HbA）患者红细胞中HbS含量约为35％，一般不表现严重的临床症状，但在高海拔进行重体力活动或麻醉均可能引发红细胞镰刀化。

镰刀形红细胞贫血是第一个证实的单一基因中一个等位基因点突变导致蛋白质分子变异而造成的分子病。

（2）血红素结合部位发生变异的Hb:

Hb每个亚基都有一个结合血红素的疏水性裂隙，除结合血红素的F8His和E7His外，其余与血红素接触的19个残基有15个是疏水残基。

上述残基发生取代涉及到血红素的结合及Hb的稳定性。

影响的大小和临床症状的严重程度取决于取代残基的性质。

例如HbM为E7或F8His被Tys取代，带负电荷的酚基与Fe3+形成络合物，把血红素锁定在高铁（Fe3+）状态，从而丧失结合O2的能力。

纯合子HbM几乎总是致死的，杂合子HbM只有一半血红素与O2结合，造成供O2不足，发绀和继发性红细胞增多。

HbM-Milwaukee-1虽是β链的Val167（E11）被Glu取代，但它与E7在螺旋同一侧，Glu的侧链羧基负电荷也能与Fe3+络合，把血红蛋白定格在高铁状态，并将E7His挤出血红素裂隙（图1.51）。

另外，HbBristolβ链67的Val被Asp取代，其侧链负电荷与E7His的咪唑基正电荷形成盐键，使血红素裂隙遭到破坏，产生高度不稳定的Hb和严重的先天性亨氏小体溶血性贫血（CHBHA）。

HbHammersmith则是由于β链血红素裂隙人口处的Phe42（CD1）被亲水的Ser取代，使水进入空穴，阻碍血红素的结合。

（3）三级结构突变的Hb：

如果多肽链中螺旋段的残基被Pro取代，或螺旋段及非螺旋拐弯处缺失一个或多个残基，均可破坏α-螺旋和肽链的构象，导致Hb稳定性下降，丧失O2结合能力。

例如HbGenoaβ26（B10）Leu被Pro取代；

HbDuarteβ62（E6）Val被Pro取代，致使Hb不稳定和严重的CHBHA。

HbFreiburgβ23（B7）Val缺失，HbGenHillβ91-95（F7-FG2）缺失，造成构象破坏，不能结合血红素，丧失氧合能力（图1.52）。

（4）四级结构突变的Hb：

Hb氧合前后四级结构发生明显改变，α1/β2或α2/β1发生位移，因此亚基界面上的突变易造成变构效应的丧失，出现异常的氧亲和力。

例如HbUakima和Hbkqempsey、HbRadclife的β亚基99（G1）Asp分别被His、Asn和Ala取代，导致脱氧Hb稳定性增大，O2亲和力升高。

HbKansasβ亚基102（G4）Asn被Thr取代，氧合态Hb的构象破坏，O2亲和力下降，患者动脉O2饱和度仅0.6而不是正常的0.97，因而明显发绀。

免疫（immunity）是人类和脊椎动物最重要的防御机制，免疫系统能在分子水平上识别“自我”和“非我”，然后破坏那些被鉴定为非我的实体。

在生理水平上免疫系统对入侵的反应或应答（respone）是多种类型的蛋白质，分子和细胞之间的一套复杂而协同的相互作用，然而在个别蛋白质水平上免疫反应是配体与蛋白质可逆结合的一个生化系统。

，如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、颗粒（细菌、细胞、病毒）进入人或动物体内时，机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白（immuneglobin），并与之结合，以消除异物的毒害。

此反应称为免疫反应，此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体。

抗体的特点：

高度特异性，多样性。

特异性是指抗体通常只能与引起它产生相应抗原发生反应，多样性是指抗体可以和成千上万的各种抗原起反应。

globin）的分类：

人免疫球蛋白分为：

IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。

抗体的四链单位：

抗体有五大类：

人类所有的抗体都具有共同的四链结构单位，在四链单位中，有两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链），重链的分子量为5×

104－7×

104，大约由450个氨基酸残基组成，轻链的分子量为2