LFY类基因在茎端分生组织形成及其活动中的作用Word格式.docx

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GUS转基因植物为材料，对其在植株“营养生长”阶段的表达特点进行过系统的研究[白书农等，未发表资料，1998]。

发现LFY基因的启动子不仅在种子萌发后不同阶段的茎端分生组织和幼小的器官原基中表达，而且在早期胚胎发生过程中也有表达。

最为引人注目的是，LFY基因启动子的活动与由根外植体再生植株过程中茎端分生组织的形成及其活动存在直接的相关。

据此白书农教授等提出，LFY基因的表达很可能与茎端分生组织的形成及其活动有关，而它表达量的增长水平和开花相关联。

但是，有研究表明，以GUS等报告基因所显示的启动子活动模式可能并不一定反映该启动子对其原有基因表达的时空调节模式。

因为基因的表达不单需要启动子的活动，还和一些其他因子，例如内含子等有关。

因此，要真正了解LFY基因在分生组织形成与活动过程中的表达特点，还应有对其转录产物即mRNA进行原位检测的证据。

本课题即是在本实验室过去工作的基础上，试图从正常植株与组培过程再生植株中LFY启动子活动方式的检测和LFY基因转录产物的直接检测两个方面，对LFY类基因早期表达特点及其可能的功能等关键问题进行进一步地探讨。

本课题研究中主要涉及两种基因表达的检测技术。

当研究LFY启动子活动方式时，我们采用报告基因的表达分析方法。

报告基因通常编码一个在离体条件下易于检测的酶，或者编码可以在活体条件下进行组织化学定位的蛋白，这样就可以提供基因表达定量的和定性的信息。

gusA基因是从大肠杆菌（Escherichiacoli）中分离出来的，并且目前有一些基因盒可以允许在gusA基因的附近插入启动子区，产生转录融合基因或翻译融合基因。

我们实验所用的Plfy:

GUS拟南芥和Plfy:

GUS烟草、Pnfl:

GUS烟草即是在gusA基因前插入LFY或NFL基因的启动子（Plfy或Pnfl），当Plfy或Pnfl活动时，带动gusA表达，利用一个简单的组织化学检测就可以精确地分析gusA融合基因的时空表达模式。

用5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸（X-gluc）作为底物可以精确地进行GUS活性的定位，这一反应分两步进行：

首先是切割葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。

用GUS进行这类实验有如下优点：

（1）在大多数植物组织中GUS活性的本底低；

（2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累；

（3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。

当然，也存在一些缺点：

（1）组织化学染色后植物失去继续培养的可能，这样不能跟踪检测同一株植物不同时期的基因活动情况；

（2）由于酶和产物非常稳定，因而不能真实的反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；

（3）人们发现在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象，但是，这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾或者二者都加（终浓度为5mmol/L），来使这种渗漏减至最少（Stomp1990;

Masarenhas和Hamilton1992）；

（4）同所有的组织化学方法一样，其检测结果不是定量的。

而且，最致命的缺点是，启动子的分析不一定总能反映基因的真实活动情况（如前文所述），这是在运用报告基因方法进行基因表达特征分析时必须注意的一个问题。

当检测LFY基因的转录产物时，我们用到了原位杂交（insituHybridization,简称ISH）技术。

该技术最早是由Gall和Pardue（1969）及John等（1969）独立发明的。

其基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则（A-T,C-G）,将有放射性或非放射性标记的外源核酸（探针：

Probe）与染色体上经过变性后的单链DNA互补配对,结合成专一的核酸杂交分子,再经一定的检测手段,将待测核酸在染色体上的位置显示出来。

我们采用的mRNA水平的原位杂交技术，是将含有目的基因cDNA的质粒分别用限制性内切酶从目的片断的两端单切，使质粒线性化。

然后从两端用不同的转录酶按照A-U,C-G的互补配对原则合成一段RNA片断，其中UTP上标记地高辛，这标记上的RNA片断即为探针。

当目的基因表达时，mRNA能和反义探针特异性结合，在底物的作用下显色。

而正义探针为负对照。

由于RNA原位杂交技术能够精确确定基因表达的时空分布，而植物基因的时空表达研究是探讨植物生长发育机制的重要手段，所以在以研究植物发育机制为主的本实验室，原位杂交成为一项主要的并十分关键的技术。

目前植物研究中，原位杂交得到了越来越广泛的应用，主要有3种方法:

一是常规组织切片RNA原位杂交，广泛适用于各种组织;

二是大量细胞的整体RNA原位杂交,已应用于花粉管和藻类合子;

三是微量细胞的整体RNA原位杂交,用于分离胚囊。

我所使用的整体原位杂交技术，是一种较新的组织RNA原位杂交方法。

该方法的实验材料是具有完整形态结构的植物器官或其组合，如花、花序等。

该技术能够直接从整体结构上观察到基因表达的空间特征，具有易操作、周期短等特点，并避免了一般在切片上原位杂交所需的三维重构步骤。

材料和方法

1．实验材料

1.1植物材料

野生型拟南芥种子（Columbia）

Plfy:

GUS转基因拟南芥种子（由DetlefWeigel提供）

野生型烟草种子（Nicotianatabacunvar.Wisconsin38）

GUS转基因烟草种子（由本实验室毕业博士生刘复权构建、提供）

1.2菌种和质粒

大肠杆菌DH5ɑ

质粒：

Pnfl:

GFP（KanR）

antiLFY（KanR）

PDW124-LFY（AmpR）

以上质粒均由本实验室已毕业博士生刘复权构建，本实验室保存。

1.3分子生物学和生化试剂

各种限制性内切酶购自TaKaRa公司，PCR试剂购自鼎国生物公司，原位杂交地高辛标记RNA探针试剂盒及杂交液（DIGeasyHyb）购自Roche生物公司，各种激素和抗生素以及x-Gluc购自北京经科生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.4PCR引物

以GFP基因为模板的PCR引物由本人设计，上海生工生物工程公司合成。

5’GFP（21bp）:

5’-GGTGAAGGTGATGCAACATAC-3’

3’GFP（18bp）:

5’-GAAAGGGCAGATTGTGTG-3’

1.5x-Gluc染色液（1mL）

N、N—二甲基甲酰胺50uL

x-Gluc0.5mg

100mM磷酸缓冲液pH7.0980uL

5mM铁氰化钾10uL

5mM亚铁氰化钾10uL

Tritonx-1001uL

1.6植物叶绿素透明液

乙醇：

乙酸=9：

1

1.7培养基

1.7.1拟南芥、烟草组织培养基

MS（含3%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.8）

愈伤组织诱导培养基（Callus-InducingMedium,CIM）:

B5+0.5mg/L2,4-D+0.05mg/LKIN

（含2%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.5）

生芽培养基（Shoot-InducingMedium,SIM）:

B5+0.15mg/LIAA+5mg/L2ip

（含2%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.5）

1.7.2细菌培养基

LB培养基：

每升培养基含5克酵母提取物，10克蛋白胨，10克氯化钠，pH=7.5，固体培养基含1%琼脂

1.8原位杂交所需试剂

PBS:

0.13MNaCl,0.007MNa2HPO4,0.003MNaH2PO4,0.27mMKCl,pH7.4

PBT:

PBS+0.1%Tween20

固定液（FB）:

PBT+0.08MEGTA,5%多聚甲醛,10%DMSO（pH7.4）

NTE:

500mMNaCl,10mMTris-HCl（pH7.5）,1mMEDTA

封阻液（BS）:

PBT+2%BSA

渗入液（SB）:

100mMNaCl,50mMMgCl2,100mMTris-HCl（pH9.5）,0.1%Tween20

停止渗入液（SSB）:

PBT+20mMEDTA

2．主要方法

2.1质粒载体构建部分

2.1.1原质粒的酶切

将Plfy:

antiLFY，Pnfl:

GFP用XbaI和SacI双切，得到Plfy-载体和GFP片断。

2.1.2从凝胶中分离纯化DNA片段

（1）切下含有DNA片段的胶块，转移到1.5ml离心管中,于70℃温育直至胶完全融化.

加1ml树脂（resin）,混合20秒.

（2）去掉注射器上的推进器，将Minicolumn安上。

（3）将树脂/DNA混合液移入注射管中，慢慢插入推进器，轻轻将悬浮液推进Minicolumn中。

（4）从Minicolumn去掉注射器，取出推进器。

再安注射管于Minicolumn上。

加2m1的80%异丙醇于注射管中洗Minicolumn。

插入推进器，缓慢将异丙醇推过Minicolumn。

（5）去掉注射器，将Minicolumn放在1.5ml离心管中，离心2分钟，使树脂/DNA干燥。

（6）将Minicolumn移入一个新的离心管，加50ul水或TE，放置1分钟，离心20秒，溶下DNA片段。

（7）仍掉Minicolumn.纯化的DNA储藏于4℃或-20℃。

2.1.3连接

在冰上建立如下连接体系:

2*T4DNA连接酶Buffer5uL

Plfy-载体1uL

GFP3uL

T4DNA连接酶1uL

轻轻混匀后，4℃连接过夜。

2.1.4大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞的制备

（1）从LB平板上挑取E.coliDH5ɑ单菌落接种于2mLLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，取100-200uL菌液于2mLLB中，37℃振荡培养2-3小时后全部转入100LB中，37℃振荡培养2-3小时至对数生长期（OD600=0.4左右）。

（2）无菌条件下转入1.5mLEppendorf，冰浴10min。

（3）4℃4000rpm8min，回收细胞。

（4）用400uL冰预冷的CaCl2（0.1M）重悬沉淀，置于冰上15-30min。

（5）4℃4000rpm8min，回收细胞。

（6）用100uL冰预冷的CaCl2（0.1M）重悬沉淀，备用。

2.1.5转化

（1）100uL感受态细胞中加入1.5uL质粒，轻轻旋转，混匀内容物，冰上

置30min。

（2）42℃水浴90s，不要摆动试管。

（3）快速将试管转移至冰上，冷却2min。

（4）每管加入200uLLB，37℃振荡45min—1hr。

（5）涂板（Kan）。

（6）至液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养。

2.1.6提质粒

用小量碱法提取质粒：

（1）取1.5mL菌液转移至Eppendorf管，于4℃，12000rpm离心30”。

（2）吸去上清，空气干燥沉淀。

沉淀悬浮于100ul溶液Ⅰ中（25mMTris-HClpH8.0,10mMEDTA,50mM葡萄糖）中，振荡混匀室温放置5分钟。

（3）假如200ul溶液Ⅱ（0.2MNaOH,1%SDS），放冰浴中5分钟。

（4）再加入150ul溶液Ⅲ（3MNaAc,pH4.8），放冰浴中5-10分钟，12000rpm4℃离心5分钟。

取上清加等量酚：

氯仿，振荡，4℃，12000rpm2分钟。

（5）取上清加2倍体积乙醇，振荡，置2分钟。

（6）4℃，12000rpm2分钟，吸去上清，沥干。

（7）加1mL70%乙醇洗涤2次。

（8）用50ulTE溶解（加入1ulRnase）。

2.1.7酶切鉴定及PCR鉴定

所用限制性内切酶及PCR引物如前2.1.1及1.4所述。

2.2GUS活性的组织化学定位部分

2.2.1组织培养

（1）将植物长出两周的主根切下成5-10mm的小段，转移至CIM中诱导其长愈伤。

（2）三周后，将愈伤组织转移至SIM中诱导其长芽。

（3）设未转基因植物作负对照，对照和处理之间的培养条件要完全一致。

（4）不论在CIM中还是在SIM中，培养基要每1-2周续代一次，及时更新。

（5）注意大量培养，在由CIM转移至SIM的同时，应保留一部分材料作CIM续代，以此作为SIM培养下的处理的另一种对照。

（6）实验过程中特别要注意无菌操作！

2.2.2GUS活性检测

（1）当植物的根在CIM中培养时，每隔2-3天作一次GUS组织化学染色进行跟踪监测。

（2）当愈伤组织在SIM中培养时，每隔一周左右作一次检测。

等到长出再生芽和再生根时，切下芽和根分别作检测。

（3）未转基因的对照必须和处理始终同步进行。

（4）设置重复，至少3-5次。

（5）具体方法：

a.无菌操作，将要检测的植物部位小心切下来，转入GUS染液，使材料和染液的体积比<

1:

5。

b.真空处理2-10分钟。

c.放入37℃恒温箱中温育12-16小时。

d.待GUS渗入材料中后，材料转入透明液中透明，放置于室温下3小时。

2.2.3观察和照像

经透明处理后的植物材料在Motic解剖镜下观察，有GUS表达的部位显

现稳定、不溶于透明液的蓝色。

解剖镜上接理光XR-X2000相机照相，

相片通过AcerScanPrisa640U型扫描仪输入电脑，由AdobePhotoshop6.0

作适当处理。

2.3整体原位杂交

2.3.1探针标记

限制性内切酶消化质粒

LFY：

antisenseBamH1

SenseKpnI

（1）37C消化2小时，电泳检查线性化是否完全；

（2）加等体积酚-氯仿，混匀；

（3）12000转离心10分钟，收集上清，

（4）加2倍体积无水乙醇（预冷），混匀，-20C，30分钟；

（5）12000转离心10分钟，弃上清，

（6）加70%乙醇（预冷），弃上清，

（7）真空干燥，沉淀溶于10微升无菌水中；

（8）电泳检测。

体外转录

（1）每个反应体系内含：

模板4微升，5*缓冲液4微升，DTT2微升，RNABlock1uL，5*NTP4微升，Polymerase2微升，DEPC-H2O3微升。

37C2小时。

antisenseT3

SenseT7

（2）DnaseI于37C处理15分钟以除去模板，每个体系加2.5微升的3MNaAc和75微升的预冷的无水乙醇，-20C过夜，

（3）4C下离心15分钟，13000转；

（4）70%预冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升DEPC-treatedH2O。

碱性水解

（1）50微升探针加50微升碳酸缓冲液，60C水解，LFY45分钟，每管加10微升5%乙酸，置冰上；

（2）每管加11微升的3MnaAc，200微升预冷无水乙醇，-20C过夜；

（3）4C下离心15分钟，12000转；

（4）70%预冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升甲酰胺。

2.3.2原位杂交

（1）固定

FB30min

甲醇2次5min

乙醇4次5min

（2）杂交预处理

乙醇2次2min

1乙醇:

二甲苯30min

乙醇2次5min

1甲醇:

PBT10min

PBT+5%甲醛30min

PBT3次2min

PBT+40ug/mL蛋白酶K10-15min

PBT+0.2%甘氨酸5min

PBT2次2min

PBT+5%甲醛30min

PBT4次2min

1PBT:

HS10min

HS2次2min

预杂交2hr60℃

（3）杂交

400uLHS+3uLRNAprobe+salmontestsDNA（100ug/mL）

（探针和salmontestsDNA预先85℃变性5min）

16-20hr60℃

（4）杂交后处理

HS2次30min55℃

1HS:

NTE60min

NTE2min

NTE+40ug/mLRnaseA45min37℃

NTE15min37℃

NTE5次15min

1NTE:

PBT20min

PBT2min

BS至少30min

（5）检测

anti-DIG抗体处理

a.等量混合固定后的和新鲜材料+少量冰冷90%丙酮，液氮中磨成细粉

b.加入更多90%丙酮，使劲混合均匀，4℃储存过夜

c.13,000g5min离心，弃上清。

在少量90%丙酮中重悬沉淀，将沉淀分散于一滤纸上，风干

d.在30mg干粉中加入400uLBS和20uLanti-DIGFabfragment，室温黑暗中24hr

e.10,000离心3min

信号检测

BS100uL中加入1uLe中上清，4℃过夜

新鲜BS10min

PBT4次60min

SB2次5min

1mL中加入8uLRoche公司的nitrobluetetrazoliumchloride+5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate5-60min黑暗中显色

显色完毕后用SSB终止反应

（6）观察和照像

用甘油:

PBS7:

3溶液封片，在OLYMPUS显微镜下观察并照像，相片通过AcerScanPrisa640U型扫描仪输入电脑，由AdobePhotoshop6.0作适当处理。

实验结果

1.拟南芥中LFY启动子活动特点的验证

白书农教授等早年曾利用Plfy:

GUS转基因拟南芥为材料，系统检测过在植物发育早期的SAM中和以根为外植体的植株再生过程中Plfy的活动特点。

我首先重复了该实验，以便熟悉各个步骤和操作，同时也进一步验证该实验的可重复性。

实验方法如2.2中所述，结果见图1所示。

早在幼苗长出的第二天，GUS活动就在SAM中表现出来（图1-A）。

而在茎的其他部位、成熟的叶片和根中，没有Plfy的活动（图1-B）。

为了避免SAM中已存在的GUS活性干扰，本实验以无GUS活动的根为外植体进行植株再生。

当将根移入CIM中诱导愈伤时，第二天就在成熟根外周区域有细胞分裂的地方发现了微弱的GUS表达（图1-D）