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第一篇常用生物化学实验技术及原理
第一章透析
透析是利用小分子能通过,而大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。
通常的做法是将小分子和大分子的混合物放进用半透膜制成的透析袋里并沉没在大量的水中。
袋内的小分子就不断通过膜进入外部溶剂中待达到平衡为止。
如果对流水透析或不断更换透析袋的溶剂可以做到袋内的混合物几乎不含小分子。
透析的速度受一些因素的影响。
下面就粗略地讨论这些因素。
一、膜
1、材料火棉胶是最常用的透析袋材料。
各种规格的火棉胶袋已做成商品出售。
也可用玻璃纸代替火棉胶。
2、制备先将一适当大小和长度的透析管放在碱性EDTA溶液中沸腾30分钟以避免待透析的分子损失活性。
然后，用蒸馏水洗涤透析管。
结扎管的一端并将所研究的材料充满透析管（袋），然后结扎顶部。
透析最好在新制备的管中进行，因为湿的透析袋非常容易受微生物感染。
如果必须保存透析袋，则应有溶液中加入痕量的苯甲酸。
3、通透性透析袋的通透性因袋的大小和预处理的方法不同而异。
但透析过夜时，半透膜大体可以允许相对分子质量（Mr）30000以下的化合物通过。
实际上没有严格的界限，透析时间延长时稍大的分子也透过膜。
有一系列的商品材料有更高的透析速度和更精细的通透范围可做精细分离之用。
二、溶剂
1、水溶液一般说，透析的速度在蒸馏水中最大，虽然通常需要特定的pH和离子强度的水溶液来稳定所研究的分子。
2、大分子溶液透析时水将进入透析袋，因此应该将透析袋装满以避免透析的材料过于稀释。
如果用一种不活泼的高分子化合物如聚乙烯醇6000代替通常使用的水溶液作为溶剂，则透析时水就会由透析袋中渗出，用这种方法透析过夜，可将200mL溶液浓缩至几mL。
三、物理条件
1、温度透析速度也受温度的影响，温度越高透析速度越快。
提高温度时，溶剂的粘度降低而扩散速度增加。
此外，许多大分子对温度很敏感，因此蛋白质等的透析通常在低温条件下进行。
2、压力大分子和小分子的分离也受通过膜时的压力梯度影响。
可将透析袋放在真空中（而不放在溶液中），并敞开透析袋的一端，此时水和小分子会渗出透析袋形成超滤液，而留在透析袋中的大分子被浓缩。
这个过程称为超滤。
四、董南（Donnan）膜平衡
由于大分子电解质的存在，而使一般电解质不均等分配在半透膜两侧的平均状态，称为膜的平衡。
蛋白质溶液的渗透压与溶液的pH有关系。
有酸性pH下，蛋白质以阳离子存在，带有正电荷；
而在碱性pH下，以阴离子存在，带有负电荷。
当蛋白质盐溶液透析时，带电的蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中对立的阴离子或阳离子就要通过半透膜以平衡电荷，这就导致离子的膜两边不均等的分布，同时关系到pH的变化。
这种现象有就称为董南效应，又称分布，同时产生pH的变化。
这种现象就称为董南效应，又称董南平衡。
如带负电荷的蛋白质盐溶液对水透析时，蛋白质不能透过透析袋，而它的反离子可以通过，结果造成环境介质中阳离子过多。
为了保持中性，水就分解出氢离子移进透析袋内，蛋白质部分的pH因此下降而水部分的pH上升。
反之，如蛋白质带正电荷，则pH的变化相反。
董南效应可以导致蛋白质沉淀或变性，因而是不可取的。
为减少董南效应，透析通常对具有适当浓度的盐溶液进行。
第二章层析法
层析法也称色谱法，是一种物理的分离方法。
它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。
层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有许多种类，可以根据所用两个相的状态和操作方式不同进行分类如表3-1。
表2-1层析法的一般分类
固定相
流动相
操作方式
名称
固体：
吸咐剂
离子交换剂
固体
液体
气体
柱型
薄层
柱层
纸
吸附层析
离子交换层析
吸附薄层层析
分配层析
分配薄层层析
纸层析
气体吸咐层析
气体分配层析
此外，还有凝胶层析、亲和层析和高压液相层析等方法。
在讨论几种常用的层析法之前，先介绍一下柱层析法的一般技术。
一、柱层析法的一般技术
1、柱层析柱通常是玻璃的。
总的说来，长柱分辨力好，但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。
2、层析材料的准备许多材料都可在层析法中使用。
在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。
例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到需的电离形式。
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低
3、装柱层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。
让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。
用溶液彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。
最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。
4、加样上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。
将样品仔细加到层析床的表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。
5、洗脱下一步是用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。
在取代扩展法中，溶剂与层析材料的相互作用比柱上的物质与层析材料的相互作用要强，于是与柱结合的分子被取代。
每一个柱能结合多少物质都有一个限度（即总柱容量）。
在取代扩展的情况下，当样品上柱量差不多达到总柱容量的50%时，一般尚能完全完分离。
但是为了得到更好的分辨力，洗脱法更为可取。
洗脱法是最常用的方法。
使用洗脱法，上柱量不超过总柱容量的10%，溶剂与柱相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。
在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。
在一个组分被洗脱后可以更换洗脱液，这就是所谓的分步洗脱。
另外，还有一个可行的方法是逐渐改充溶剂的性质，形成一个离子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱，这种方法称梯度洗脱，它的优点之一是能够减少拖尾现象。
6、部分收集及分析柱的流出液可以用人工的方法收收集到一系列试管中或使用部人收集器。
这种装置能使每一管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。
洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。
第一部分的蛋白质或核酸的含酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280nm或260nm的光吸收来进行连续监测。
二、几种常用的层析法
（一）吸附层析
这是首次由Tswett用来分离色素的层析方法。
吸附剂的经典含义可能说成是一种表面具有吸咐分子的特性的固体（特别是当它是多孔的和分得很细的时候）。
如氧化铝、硅胶、活性炭等固体物质都具有吸附性能，可以将一些物质自溶液中吸附到它的表面。
它和离子交换换树脂不同，吸附剂表面和分子的吸引力，理论上不含有静电力。
吸附可以是非常特异的，以致于可以从一个混合物中选择性地吸附一种物质。
用这种方法所以能进行各种成分的分离是由于它们被吸附剂所吸附的程度以及它们在分离用的溶剂中的溶解度有差异。
当然这些特点是由各成分的分子结构所决定的。
例如，在柱吸附层析中，混合物的分离是在装有适当吸附剂的玻璃柱中进行的。
混合物加到柱上，然后用一个适当的溶剂（或是混合溶剂）通过这个柱。
混合物就随着溶剂的流动而逐渐分开。
最初溶剂刚倒在吸附柱上时，混合物被吸附剂逐渐分开。
最初溶剂刚倒在吸附柱上时，混合物全被吸附剂吸附在柱的上层，当继续加入溶剂时，柱中就会连续不断地发生混合物中各物质的溶解，吸附，再溶解，再吸附的反复交替过程。
如被吸附的某物质被溶剂解出来（解吸作用）后就随着溶剂向下面流动，当遇到新的吸附颗粒时，又从溶剂中吸附出来，后面继续流下来的新溶液又再把它溶解出来并被带着往下移动，又再被吸附。
就这样，经过一段时间之后，混合物中各物质都会从柱顶向下移动一段距离，但是由于各物质被吸附剂吸附的程度以及它们被溶剂溶解的能力不同而向下移动的距离不同因而彼此分离。
吸附性弱的，就比较容易被溶剂溶出，又因为它再被吸附的力量比较弱，所以在柱中移动的距离就大些。
经过适当的时间后，混合物中各物质就可以完全分开。
现在一般最常用的方法是在各组分离以后，让柱继续展开，用溶剂把被吸附的物质由吸附柱上冲洗出来，部分地收集从柱上流出的洗脱液，随后再进行分析。
对任何一种特殊的吸附剂和溶剂洗脱系统的选择由所要完成的分离来决定。
在选择吸附剂时必须小心，因为有时一些吸附剂在分离时可引起某些化合物的降解。
吸附层析的操作方式在柱型和薄层两种。
具体操作技术请见本章“一、柱层析法的一般技术”和“（四）薄层层析”两部分。
（二）离子交换层析
离子交换层析利用含有能与周围介质进行离子交换的不稳定离子的不溶性基质来分离分离物质。
1、离子交换基质Adams和Holnes有1935年通过酚、甲醛和磺酸缩聚成不溶性树脂，制成了第一个人工合成的离子交换材料。
从此以后，人工合成的离子交换树脂日见增多（多数是从芳香族化合物合成的），由苯乙烯及交联剂二乙烯苯聚合得到的物质是一种常用的树脂基质。
通过适当的反应再将可电离基团引入到芳香环上，二乙烯苯和苯乙烯的相对含量决定了聚苯乙烯链之间的交联度。
交联度是指这种树脂骨架中含有二乙烯苯的重量百分率。
国产树脂的交联度一般为4%~14%。
树脂的交联度小时，则水溶性强，加水后树脂的膨胀性大，网状结构的网眼大，交换反应快，交换选择性低。
相反，树脂的交联度大时，则水溶性弱，加水后树脂的膨胀性小，网眼小，交换慢，具有一定的选择性。
离子交换树脂适合分离小分子物质，如氨基酸，但对于大分子，如蛋白质是不适合的，因为大分子不能进入树脂紧密交联结构的内部。
因此大分子可以用取代的纤维素和葡聚糖来分离，这些物质的分子是纤维状的，它们的大部分功能基团在表面。
2、可电离基团按照离子交换树脂对阴离子或阳离子的亲合特性可以分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
例如，阳离子交换树脂交换周围介质的阳离子，也就是说，决定树脂究竟是阴离子的还是阳离子树脂的可交换离子所带的电荷，而不是基质上所带的电荷。
这两种类型又可进一步分成含有强电离基团的，如强酸型和强碱型；
及弱电离基团的，如弱酸型和弱碱型。
强离子交换树脂是完全电离的，并以带电形式存在（在极端pH值时例外）。
弱离子交换树脂所含基团的电离程度依pH一个狭窄的pH范围有最大交换容量方能使用。
一般含羟基的树脂在pH6左右有最大容量，而带有氨基的那些树脂在pH低于6时才有效。
离子交换纤维素含有取代了纤维素一OH的弱电离基团，这些基团的密度比较低，因为取代太多时就会使纤维素变得可溶。
对于分离结合较弱的大分子时，用弱电离部位密度较低的交换剂适合，而且在温和条件下容易解析。
3、离子交换平衡典型的离子交换反应过程说明，在这里用含有氨基的阴离子交换树脂分离两个负电性离子。
树脂可电离基团的浓度几乎可以达到6~10mol/L，因此有很高的交换容量。
虽然一般以为离子交换树脂的作用仅仅是通过离子交换过程来分离物质，但实际上也可能存在吸附作用和分子筛作用。
4、结合离子的洗脱结合离子可以通过改变缓冲的pH来洗脱。
例如，当pH靠近一种蛋白质分子的等电点时，这种蛋白质分子的净电荷就减少，与树脂的结合就减弱而被洗脱，别的带电的蛋白质仍然结合在柱上，这样就达到了分离的目的。
另外，溶剂中的离子要与结合离子对离子交换剂的可电离基团发生竞争，溶剂中的离子浓度高时，就会取代结合离子，所以增加离子强度也可将结合离子洗脱。
pH或离子强度可以通过更换洗脱缓冲液陡然地改变，可用前面介绍的梯度方法逐渐地改变。
离子与树脂的结合是一种动态平衡，其结合程度取决于树脂的性质、温度、离子强度和溶剂成分。
同时还与树脂的电离度和被分离的物质有关。
高价离子最容易结合而不易洗脱，所以在用一种高价离子取代结合离子时应使用稀溶液，而如果要导入一种低价离子时则需用浓溶液。
5、离子交换材料的准备树脂和取代多糖（取代纤维素、取代葡聚糖）首先要在蒸馏水中吸胀，并去掉过细的颗粒。
商品树脂，特别是阳离子交换剂会含有铁或其他重金属，可以用2~4mol/L的盐酸洗涤去除。
通过用适当的溶液洗涤可获得所需要的离子形式的离子交换材料。
例如，氢型的阳离子交换树脂是先用盐酸洗涤，然后用水洗涤直至流出液呈中性为止。
同样制备钠型是用氯化钠或氢氧化钠溶液洗涤树脂，再用水洗涤至中性。
装柱前的最后一步是用洗脱缓冲液平衡树脂，显然缓冲离子必须是不与树脂结合的。
6、离子交换层析的操作技术详见本书第三篇演示实验二。
（三）分配层析
常用吸附层析分离法易溶于有机溶剂而难于水的混合物。
可电离的水溶性混合物最适宜用离子交换层析法分离。
分配层析法界于二者之间，在水和有机溶剂中都可溶的混合物用分配层析法易分离。
当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。
达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是所谓的分配系数（a）。
分配层析法实际上是一种连续抽提法。
在这里，一种溶剂通常是被结合在固定的惰性支持物（柱或膜）上的水，另外一相由流动的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相，如果某一混合物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。
1、纸层分析的理论Consden，Gordom和Martin首先用滤纸作支持物并以茚三酮为灵敏显色剂，建立了微量而简便的分离蛋白质水解液中氨基酸的方法。
不久又发现除了氨基酸外，糖、核苷酸、甾体激素、维生素、抗生素等很多物质都能用纸上层析法分离，因而纸层析成为生物化学工作中一种常用的分离分析方法。
滤纸是理想的支持介质。
在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。
由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。
当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶剂就在水相和有机相之间进行分配，且部分溶质离开原点随有机相移动而进入水相。
当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。
溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。
等纸干后，可用适当的显色方法使混合物中各组分在纸上的位置显示出来，物质移动的距离与溶剂移动距离之比就是Rf值。
某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf值基本上是常数。
如果固定相不完全是惰性的，那么既发生分配，又有吸附作用和可能的离子交换，Rf和a的关系等式就会有例外。
2、样品的制备和点样在研究生物材料时，做层析以前样品要脱盐（用离子交换或电渗析），过量的盐会使层析谱扩散和Rf值改变，同时还会影响辨认分离组分的化学反应。
在层析前还可用超滤或葡聚糖来除掉蛋白质。
然后用微量点样管将样品溶液（2~20µ
L）点于纸上，点的直径不超过0.3~0.5cm，如样品太稀需重复点几次时，每次点之前均应吹干，点间距离约2~3cm。
3、纸的选择滤纸的质地必须均一、平整及厚薄均匀，要有一定的强度。
一般分析工作可采用新华1号滤纸（或Whatman1号），若有较多的样品需要在纸上分离提纯时则适合采用新华3号（或whatman3号）厚纸，可是其分辨力比1号滤纸差。
溶剂顺着纸的纹道扩展速度快，否则速度慢。
必要时，使用前可将滤纸用缓冲液浸泡或经乙酰化作用进行化学修饰。
4、溶剂的选择溶剂的选择与纸的选择一样，主要是根据经验，同时也取决于所要分析的物质。
如果在溶剂A中样品物质移动离溶剂A的前沿近，那就是溶解度太大；
如果在溶剂B中它们靠近原点周围，那就是溶解度不够大，因而合适的溶剂应该是A和B的适当的混合物，以使样品各组分的Rf值能在整个纸的长度上散布开，在某些分离中pH是一个重要因素，很多溶剂含有乙酸或氨以形成一个酸性或碱性的环境。
5、展层虽然展层的方式可以不同，但其共同点都是将点好样品的滤纸固定，使其一边与溶剂槽接触，让溶剂扩展，整个装置扣在密闭的容器内，槽壁衬垫浸透溶剂的滤纸以保持恒定的蒸气压并且放在恒温室里，温度的波动全使溶剂走得不均匀，并改变Rf值。
展层方式有上行、下行和环行。
上行层析是比较常用的方法，它的优点是可以在两个方向上进行（即双向层析）。
混合物先在第一种溶剂中被分离（溶剂应是挥发性的），干燥后将纸转900，再在第二种溶剂中进行层析。
显色或用其他方法定位后得到的层析图谱与在相同条件下已知物的层析图谱比较就能鉴定混合物的各组分。
下行层析适用于一些Rf值接近的混合物。
因为溶剂滴离纸的底部，这就能使各组分较充分地分离。
当然在这种情况下不能测定Rf值，而只能与标准参考物，如葡萄糖相比较。
6、显色大部分化合物是无色的，可以用特殊的显色剂使其显色，配制显色剂时最好使用与水不混溶且挥发性较大的溶剂。
显色剂可用喷雾器喷雾或迅速将纸在显色剂中浸渍。
如果被分离物质本身具有紫外吸收性质，可在紫外线照射下与纸的荧光背景对照显出暗的斑点。
另外，有些化合物在紫外线下发出特殊的荧光。
（四）薄层层析
и3MaÑ
JIOB和IIIpaÑ
бep在1938年叙述了植物萃取物在氧化铝薄层上的分离，但是直到1956年以后薄层层析才逐渐引起各方面的注意和重视。
薄层层析法是将支持物在玻璃板上均匀地铺成薄层，把待分析的混合物加到薄层上，然后选择合适的溶剂进行展开，而达到分离鉴定的目的。
薄层层析兼有柱层析和纸层析的优点。
它操作方便，设备简单，展开时间短，一般只需几分钟到几十分钟。
它灵敏度高，适用于微量样品的分析（小到0.01mg），但是加大薄层的厚度则又能分离较多（大到500mg）的样品。
薄层层析还有一个优点是除了可用一般显色剂外，对某些薄层材料还可用腐蚀性显色剂，另外，还可以在支持物中加荧光染料以有助于点的鉴别。
薄层层析法分离物质的原理依所用不同支持物的性质而不同，可以是吸附层析、离子交换层析、分配层析或是凝胶过滤。
1、薄层的制作在玻璃板上涂铺一层薄层，最简单的方法是在一根玻棒的两端绕几圈胶布，用玻棒压在玻板上，把支持物向一个方向推动，即成薄层。
有时用上述方法制得薄层不太均匀，可能用有机玻璃自制一个涂铺器即能取得满意的结果。
薄层厚度小于200um时将影响Rf值，一般情况下厚度为250um比较合适。
可做薄层材料的物质很多，如硅胶、氧化铝、纤维素粉、DEAE纤维素、葡聚糖等，具体选择哪一种依所研究的问题而定。
硅胶对大多数的物质分离都是适宜的。
有时在硅胶中加入煅石膏作为粘合剂，这时一旦与水调合就需快速操作。
2、展开薄层层析的加样与纸层析基本相同。
薄层的展开需在密闭的器皿中进行，溶剂必须达到饱和，可以在器皿内部贴上浸湿了溶剂的滤纸条。
薄层层析的展开方式与纸层析一样，可以是上行、下行、单向或双向。
3、定位和纸层析一样，可用适当的显色剂喷雾或根据组分的紫外线吸收或荧光来定位。
在有放射性物质时用扫描来定位。
（五）凝胶层析
1、凝胶层析也称凝胶过滤法，是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。
这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。
用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。
现以利用交联葡聚糖分离物质和测定相对分子质量为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。
交联葡聚糖（商品名Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基的多糖）用交联剂环氧氯丙烷交联形式的有三维空间的网状结构物。
控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。
“G”表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小。
把经过充分溶胀凝胶装入层析柱中，在加入样品以后，由于交联葡聚糖的三维空间网状结构，小分子能够进入凝胶，较大的分子则被排阻在交联网状物之外，因此各组分在层析床中移动的速度因分子的大小而不同。
相对分子质量（Mr）大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，其流程短，移动速度快，先流出层析床。
相对分子质量小的物质可以透入凝胶颗粒，流程长，移动速度慢，比相对分子质量大的物质迟流出层析柱。
经过分部收集流出液，相对分子质量（Mr）不同的物质便互相分离。
SpladexG-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。
G-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。
G-75到G-200可用于分离相对分子质量大于10000的蛋白质。
交联葡聚糖分子含有大量的羟基，极性很强，易吸水，所以使用前必须用水充分溶胀。
1g干重凝胶充分溶胀时所需的水量（mL）称为凝胶的得水值（Wr）。
因为得水值不易
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