摘要为克服虫草素在体内被腺苷脱氨酶作用脱氨基转化为3Word格式文档下载.docx

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五、专家组评价意见：

专家签名（盖章）：

六、审核意见：

分管院长签名（盖章）：

学院：

生命科学学院

指导教师：

凌建亚

完成人：

合作人：

年级及专业：

02级生命科学基地班

[摘要]

为克服虫草素在体内被腺苷脱氨酶作用，脱氨基转化为3’-脱氧肌苷而失去药效的缺点，本实验利用LDH纳米材料，使用纳米插层技术，制备出虫草素/LDH纳米复合体，将虫草素制备成微粒或纳米粒，通过靶向及缓释给药以达到提高疗效，减少毒副作用，提高药物的生物利用度的目的。

本实验利用了离子交换法将虫草素插入到LDH中，并对得到的复合体进行了进一步的表征。

X射线衍射、透射电镜以及毛细管电泳的结果都表明，虫草素可以插入的层状氢氧化物的层间，这就意味虫草素有可能作为纳米粒药物进行使用。

同时，氨基酸药物也有在体内生物利用度低，无法发挥应有作用的缺点，因此我们也对缬氨酸（Val）和组氨酸（His）进行了LDH纳米差层的研究，并进行了X射线衍射、红外图谱、热重分析以及透射电镜的表征实验，结果都表明Val能插入到LDH中，而His则无法插入，并且插层的Val可利用Na2CO3从Val/LDH复合体中洗脱了下来,因此，我们可以将Val/LDH复合体作为制备其它氨基酸/LDH纳米复合体药物的前驱体。

同时，利用Val和His不同的插层能力,可将Val和His这两种氨基酸进行分离，从而得到了一种新的氨基酸分离方法。

[关键词]

层状双氢氧化物（LDH），纳米复合体，虫草素，缬氨酸，组氨酸

[前言]

虫草素具有广泛的生物活性,但在临床前期研究中碰到相当棘手的问题:

腺苷脱氨酶作用使其脱氨基转化为3’-脱氧肌苷，从而失去药效，使得体内实验难以达到体外实验的效果，目前多采取提高用量和辅助使用腺苷脱氨酶抑制剂的方法予以解决。

但是虫草素制备成本较高，价格昂贵；

腺苷脱氨酶本身在人体中广泛存在，且其具有极其重要的生理功能，一旦缺乏会造成核酸代谢产物的异常累积，致使T、B淋巴细胞发育不全，功能障碍，从而导致严重的细胞、体液免疫缺陷，所以酶抑制剂使用量的大小就成为一个两难悖反问题。

如何提高虫草素的药效，减少用量是目前虫草素临床应用研究中的热点和难点。

医药是氨基酸相对用量不大但品种最多的一个部门，目前世界上用于药物的氨基酸及氨基酸衍生物的品种达100多种。

氨基酸在医药行业的应用包括氨基酸作为蛋白质的基本组成单位，直接参与生物体内的新陈代谢和其他生理活动，可用作营养剂、代谢改善剂、抗溃疡、防辐射、抗菌、治癌、催眠、镇痛等，作为专门疗效的氨基酸及其衍生物产品有数十种，如治疗氨中毒、肝昏迷的谷氨酸、精氨酸；

治疗支气管炎及肺气肿的半胱氨酸等等。

然而，氨基酸药物具有它的局限性,如在体内稳定性差、吸收不佳、易转化、无法达到靶位点、半衰期短等.

层状双氢氧化物LDH是由带正电荷的金属氢氧化物层和层间填充带负电荷的阴离子构成的层状化合物.LDH具有特殊的结构和性质,是一种在吸附、离子交换、催化和功能助剂等方面具有巨大潜力的新型无机功能材料。

由于其具有独特的层状微孔结构和阴离子的可交换性,且它在催化、吸附、医药等方面的应用,故一直受到人们的关注.近年来,更深层次的研究主要集中在层间插入特定的无机、有机离子或聚合物而制备具有优良性能夹层纳米复合材料.如研究发现ＤＮＡ类生物分子能稳定存在于聚合物/ＭｇＡｌＮＯ3ＬＤＨ纳米复合材料中,而制成基因的贮存库。

在医药方面对于纳米材料的研究，目前主要研究方向在于设计特殊的药物递送系统，以期增加药物对于标的细胞的专一性，并减少药物本身所引起的副作用。

Choy等（2004）利用层状双氢氧化物（layereddoublehydroxides,LDH）作为载体，递送抗癌药物methotrexate至人类骨肉瘤细胞（SaOS-2）中，可明显观察到药物所引发的细胞凋亡（apoptosis）现象。

由于LDH对细胞无毒害作用，本实验利用它做为一种无机生物纳米载体，用以包埋功能性生物分子——虫草素和氨基酸，使虫草素和氨基酸的生物功能可以更加充分的发挥，克服这两种药物的易降解转化、所需剂量大、成本高等问题。

聚合物纳米颗粒用于药物传递是现代药剂学发展的重要方向之一，纳米颗粒制剂具有普通制剂无法比拟的优点：

缓释药物，延长药物作用时间；

靶向输送药物；

减少给药剂量，减轻或避免不良反应；

提高药物的稳定性；

保护药物，防止被体内酶降解；

辅助核苷酸转染细胞；

有利于患者吸收，减少药物在其他健康细胞上的毒副作用；

提高药物疗效，降低制药成本等，上述优点也正是现代药剂学的主要目的。

同时，纳米颗粒也为体内局部给药、黏膜给药和多肽类药物的口服传递等奠定了基础。

纳米颗粒是一类极具开发潜力的新型药物载体，因此纳米技术运用在药物的运载体系上是现在制药界十分热点的课题，如果能够取得重大成果，对整个制药行业是一个革命性突破。

目前国内该方面的研究还并不充分，本实验的研究方法在一定程度上开拓了提高药物作用效用的研究思路，具有一定的创新性，特别是对于聚合物氨基酸/LDH纳米复合体的研究与应用，前景非常广阔。

[实验试剂及仪器]

1、试剂：

硝酸镁Mg（NO3）2.6H2O硝酸铝Al（NO3）3.9H2O硝酸钠NaNO3氨水NH3.H2O（含量为25-28%）

虫草素

缬氨酸组氨酸

2、仪器：

（1）D/max-rAX型X-射线衍射仪（日本理学）

（2）Nicolet50X型红外光谱仪（美国Nicolet公司）

（3）TEM-100Ⅶ型透射电子显微镜（日本Jeol）

（4）Perkin-ElmerDC/2C型差热分析仪（美国Perkin-Elmer公司）

（5）SHZ-3型循环水真空泵（河南省巩义市英峪仪器厂）

（6）MP200A型电子天平（上海第二天平仪器厂）

（7）电热恒温鼓风干燥箱（湖北黄石市医疗器械厂）

（8）JJ-1精密增力电动搅拌器（江苏金坛市江南仪器厂）

（9）QXJ超声分散仪（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）

（10）BeckmanP/ACETMsystemMDQ（美国Fullerton公司）

[实验方法]

1复合体的制备

（1）Mg-Al-LDH的制备

a.稳态法

将去离子水煮沸30分钟，N2保护下冷却到室温，作为实验用水。

将32gMg（NO3）2.6H2O（0.125mol）和23gAl（NO3）3.9H2O（0.0625mol）溶于125ml煮沸后的去离子水中，得到溶液a。

将12gNaOH（0.30mol）和17gNaNO3（0.20mol）溶于145ml煮沸后的去离子水中，得到溶液b。

将b溶液置于500ml的锥形瓶中，在N2保护下搅拌15分钟，在N2保护和搅拌下，将溶液a滴加到溶液b中，在滴加过程中，不时检测混合液的pH值，并用2mol/L的NaOH溶液调节混合液，使pH值始终等于10，1小时滴加完，然后继续搅拌3小时，80℃老化三天。

b.非稳态法

将30.77gMg（NO3）2.6H2O（0.12mol）和22.51gAl（NO3）3.9H2O（0.06mol）溶于360ml煮沸后的去离子水中，配成混合盐溶液。

再加入17gNaNO3（0.20mol），混匀。

在N2保护和搅拌下，滴加共沉淀剂6%的氨水至pH值为10。

搅拌均匀后老化1h，抽滤，用5L煮沸后的去离子水洗涤。

将抽滤好的胶在80℃下进行胶溶8h。

由于非稳态法操作简单，本实验选择了非稳态法来制备Mg-Al-LDH。

（2）虫草素/LDH纳米复合体的制备

调整[Mg-Al-NO3]的浓悬浮液至固含量0.5%，然后与0.04mol/L的虫草素溶液65℃反应4天，去离子水充分洗涤，60℃空气干燥得到[Mg-Al-Cordycepin]LDH。

（3）氨基酸插层及脱层

a插层

选择离子交换法将氨基酸插层到LDH中。

测得制备好的Mg-Al-LDH溶胶的固含量为8.5%。

取溶胶1.475g，加水至25g，得到0.5%的分散体系，然后超声5分钟，使溶液混匀。

分别将0.921gHis和0.937gVal加入到上述25g胶溶液中，使得生物分子的摩尔浓度为胶的1.5倍。

溶解后，再超声5分钟，使溶液混匀。

60℃下放置4天。

4天后，将溶液在9000r/min下离心10分钟，倒掉上清液，下层用蒸馏水洗涤两次。

60℃下烘干，得到氨基酸/LDH纳米复合体。

b.脱层

将氨基酸插层的LDH粉末溶解在100ml的25mmol/l的Na2CO3水溶液中，放置4天。

4天后，将溶液在9000r/min下离心10分钟，倒掉上清液，下层用蒸馏水洗涤一次。

60℃下烘干，得到脱层后的LDH。

2、表征

（1）测量LDH、虫草素插层复合物的X射线衍射（XRD）图；

做LDH及虫草素插层复合物的透射电镜（TEM）分析；

做LDH及虫草素插层复合物的毛细管电泳分析。

（2）测量LDH、氨基酸插层复合物及脱层后的LDH的X射线衍射（XRD）图、红外光谱（IR）图、热重分析（DTA/TG）图、透射电镜（TEM）图及层间结构分析。

[实验结果]

1、虫草素/LDH纳米复合物的表征分析：

（1）X射线衍射（XRD）分析

Fig.1XRDpatternsofA）[Mg-Al-NO3]，B）[Mg-Al-Cordycepin].

图1X射线衍射图.A，[Mg-Al-NO3]；

B，[Mg-Al-Cordycepin].

图1-A，B分别为[Mg-Al-NO3]和[Mg-Al-Cordycepin]的X射线衍射图，均表现为典型的晶态特性。

其中由文献可知，10°

（2θ）附近的衍射峰是[Mg-Al-NO3]晶格平面的特性反映，晶体层间距为8.4Å

。

当Mg-Al-NO3与Cordycepin作用后，8.4Å

的晶体层间距扩大为16.2Å

，但仍保持LDH构型，这就提示我们，虫草素与NO3-发生了交换，插入到LDH中从而获得了更大的层间自由空间。

当然，由图可见，[Mg-Al-Cordycepin]的衍射峰较小，这表明NO3-并没有完全被替代，还有相当部分的[Mg-Al-NO3]存在。

（2）样品的透射电镜观察

Fig.2TEMpictureof[Mg-Al-Cordycepin]

Fig.2TEMpictureof[Mg-Al-NO3]

图2[Mg-Al-Cordycepin]的透射电镜照片

图2[Mg-Al-NO3]的透射电镜照片

透射电镜观察显示，[Mg-Al-Cordycepin]样品表现为球状的多分散颗粒，直径50-350nm（图2），与[Mg-Al-NO3]的片状颗粒，粒径100–120nm（图4-12）差别甚大。

表明确实有Cordycepin插入到[Mg-Al-NO3]层状双氢氧化物中。

（3）毛细管电泳结果

Fig.3CZEmapsofA）[Mg-Al-（Cordycepin）]afteraddingthestandardCordycepin，

B）[Mg-Al-（Cordycepin）]，C）[Mg-Al-NO3]。

图3样品的毛细管电泳图谱.A）添加虫草素标准品的[Mg-Al-（Cordycepin）]电泳谱图，B）[Mg-Al-（Cordycepin）]电泳谱图，C）[Mg-Al-NO3]电泳谱图。

将[Mg-Al-（Cordycepin）]层状双氢氧化物配成一定固含量的胶体溶液进行电泳，实验中为提高分离效果将分离电压提高到25kV。

由图3结果显示，[Mg-Al-NO3]没有紫外吸收，10min内基线平直（如图3-C），虫草素插层样品则显示了典型的258nm紫外吸收（如图3-B），这是腺嘌呤基团π→π*orn→π*电子跃迁特征（PerkampusHH，1992）。

[Mg-Al-（Cordycepin）]的电泳迁移时间为1。

757min，利用标准品加入法予以确认（如图3-A）。

毛细管电泳结果进一步确认了虫草素插层的存在。

2、氨基酸/LDH纳米复合物的表征分析

（1）样品的XRD分析

图4.a）.LDH;

b）.His-LDH;

c）.Val/LDH;

d）.Val/LDH脱层的XRD图。

Fig.4XRDpatternsfora）.LDH;

b）.His/LDH;

d）.deintercalationofVal/LDH.

LDH、LDH与His和Val的反应物以及Val/LDH脱层的XRD分析见图4。

由图可以看出，Val插层进入了LDH层间，使得LDH层间距由0.83nm增加到1.22nm，增加了0.39nm。

而His没有插层到LDH层间，LDH层间距没有发生变化。

Val/LDH用Na2CO3脱层后，LDH层间距又从1.22nm变为0.83nm，说明Na2CO3能将Val从Val/LDH复合体中洗脱下来。

（2）透射电镜分析

图5Val/LDH的透射电镜图。

Fig.5TEMphotographsforVal/LDH

Val/LDH的透射电镜图如图5所示。

LDH纳米粒子是边长为100-120nm的正六边形，Val与LDH作用后，层间距增大表明发生了插层反应，所得纳米粒子为不规则球体，球径在200~350nm。

说明Val插层到了LDH层间，修饰了LDH片层，但所得复合物仍保持片层结构。

His与LDH作用后，纳米粒子的形状没有发生改变，仍是正六边形，说明His没有插层到LDH层间。

（3）红外分析

图6a）.Val;

b）.Val/LDH;

c）His;

d）.His/LDH的红外图。

Fig.6IRspectraofa）.Val;

d）.His/LDH.

Val、Val/LDH、His及His/LDH的红外图谱见图6。

Val的红外图谱中，在2949和2877cm－1处有C-H伸缩振动峰，在1564cm－1处为水的振动峰，在1506cm－1处为C-O伸缩振动峰（图6a）。

Val/LDH的红外图谱中，在3471cm－1处为-OH的振动峰,在2970cm－1处为C-H振动峰，在1587cm－1处为水的振动峰，在1509cm－1处为C-O伸缩振动峰,在1359cm－1处为C-N伸缩振动峰，与Val的红外图谱有相对应的峰（图6b），表明氨基酸已经插层到了LDH中，这与XRD结论相一致。

His的红外图谱中，在3014和2867cm－1处有C-N伸缩振动峰，在1630cm－1处为杂环振动峰，在1587cm－1处为水的振动峰，在1498cm－1处为C-O伸缩振动峰（图6c）。

His/LDH的红外图谱中，在3468cm－1处为-OH的振动峰,在1636cm－1处为水的振动峰，而1365cm－1处为NO3-的伸缩振动峰，与His的红外图谱没有相对应的峰，与纯LDH图完全相同，说明氨基酸没有插层进入LDH层间。

（4）热重分析

图7a）.Val-LDH;

b）His-LDH的热重分析图。

Fig.7TGAdatafora）.Val/LDH;

b）His/LDH.

His和Val与LDH插层纳米复合体TG/DTA曲线见图7。

当插入氨基酸后，吸热峰向低温度移动，表明所得插层物的热稳定性降低。

对于Val/LDH纳米复合体，其DTA曲线中出现3个吸热峰，相应热重曲线也出现三个失重台阶。

第一个失重台阶在200~220℃附近，是由LDH层片物理吸附水的去除而引起的。

第二个失重台阶在240~260℃左右，是LDH分子中脱羟基及氨基酸的降解过程，第三个失重台阶在310~400℃附近，LDH分子中的剩余羟基的脱除过程（图7a）。

对于His/LDH，其DTA曲线中出现2个吸热峰，相应热重曲线也出现两个失重台阶。

第一个失重台阶在200~220℃附近，是由LDH层片物理吸附水的去除而引起的，但降解率远小于Val/LDH。

第二个失重台阶在240~260℃附近，是LDH分子中脱羟基的过程（图7b）。

Val/LDH的热重曲线中，三个失重台阶的总失重为46%，而在His/LDH的热重曲线中，两个失重台阶的总失重为37.8%，比Val/LDH少8.2%。

这是因为Val/LDH中有氨基酸插入，而His/LDH中没有氨基酸插层。

（5）.层间结构讨论

（b）

（a）

（c）

图8a）.LDH;

c）Val脱层的层间结构图。

Fig.8schematicillustrationofa）.LDH;

c）deintercalationofVal/LDH.

LDH、Val/LDH及Val脱层的层间结构图见图8。

Val插层后，LDH的层间距增大到1.22nm，而LDH层片的宽度为0.48nm，所以Val在LDH层间的宽度为0.74nm。

已知C-C键的长度为0.17nm，而Val的长度大约为4个C-C键的长度，约为0.68nm。

由此可以认为Val在LDH层间是垂直排列的（图8b）。

[实验结论]

在实验中，我们将具有抗癌等重要生理功能的虫草素插入到层状氢氧化物LDH中，通过对其的X射线衍射、透射电镜、毛细管电泳进行分析，表明虫草素能插入到LDH中，因此，虫草素有可能作为纳米粒药物进行使用。

在实验中，我们还选用了缬氨酸（Val）和组氨酸（His）两种氨基酸，利用离子交换法将其插入到LDH中，并对得到的复合体进行了进一步的表征，X射线衍射、红外图谱、热重分析以及透射电镜的结果都表明，Val能插入到LDH中，而His则无法插入，并且插层的Val可利用Na2CO3从Val/LDH复合体中洗脱了下来,因此，我们可以将Val/LDH复合体作为制备氨基酸/LDH纳米复合体药物的前驱体。

同时，利用Val和His不同的插层能力,可利用此方法将Val和His这两种氨基酸进行分离，从而得到了一种新的氨基酸分离方法。

[讨论]

随着分子生物学和分子药理学对肿瘤本质和作用机制方面的阐明,抗癌药物的研究水平有明显提高,特别强调针对癌组织、癌细胞靶向进行设计药物及其制剂。

虫草素的抗癌作用受到广泛的重视。

以上实验证明，虫草素可以插入的层状氢氧化物的层间，这就意味虫草素有可能作为纳米粒药物进行使用。

纳米粒由于其表面的粘附性及细小的粒径,可以增加局部用药滞留时间及药物与肠壁接触时间，提高药物吸收量；

并改变膜转运机制,增加对生物膜的透过性,有利于提高药物透皮吸收与胞内靶向作用,保护药物,降低毒副作用[李超英2001]。

当然，本节实验只是虫草素纳米材料的初步研究，尚处于有意义的探索阶段，还需要大量艰苦的工作进行药剂学、药代动力学、体内药效学等的深入研究，从而实现虫草素靶向（缓释）给药系统的真正临床应用。

氨基酸/LDH新型药物剂型研究成熟，开发出临床药物后，不仅可以提高药效，节省资源，降低成本，取得高的收益，更可以拓宽相关研究思路，有利于相似相关类药物制剂的研究与开发，有助于更快更高效地缓解病痛，甚至可以通过纳米材料（如LDH）的保护，使一些本来因会被消化降解等原因而不能或微弱作用于靶细胞的高效药物制剂（如虫草素）得以发挥或增强其药效，从而提高很多疑难杂症（如肿瘤）的治愈几率，从这一意义上讲氨基酸/LDH纳米复合物也可作为制备其它高效药物制剂（如虫草素/LDH纳米复合体）的前驱体。

利用纳米科技可将生物降解性和生物相容性的聚合物与药物一起制成纳米药物，作为靶向药物制剂，直接导入病灶部位的器官、组织甚至细胞，达到提高药物疗效，降低毒性的作用；

将纳米材料作为药物载体，可增加某些药物的胃肠吸收，提高其生物利用度；

将纳米材料作为载体，可用于基因的输送和治疗；

纳米材料作为组织修复、人造器官等生物材料的应用也有很好的前景；

另外，纳米材料在疾病的诊断和监测上也有广泛的用途。

在上述领域中，纳米材料的研究进展很快，有的纳米材料已经成为产品，进入实际应用阶段；

有的纳米材料已进入临床研究阶段；

有更多的纳米材料正处于不同的实验研究阶段；

不久的将来纳米材料会给人类带来惊喜。

虽然跨越探索性研究与实际应用（尤其是静脉注射的靶向给药系统）之间的鸿沟仍然是纳米颗粒药物传递系统研究所面临的严峻挑战，但这一领域中每一个令人兴奋的进展都会鼓舞人们投入更多的精力。

随着纳米科技和纳米生物材料的不断出现和完善，将给生物学领域带来新的变革和快速的发展。