微生物限度检查方法适用性验证方案Word格式.docx

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检查工程包括需

氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。

当建立产品的微生物限度检查法时，应进展需氧菌、霉菌和酵

母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧

菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。

依照中国药典2021版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进展方法适用性试验。

2、试验目的和风险评估：

验证目的：

确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。

风险评估：

工程

潜在失效模式

失效影响

采取措施

试验局部工程出现偏差

直接影响试验结果的

严格执行经批准

未按方案执行

的试验方案

和漂移

正确性

试验过程操作不当

未到达试验标准

试验失败

未严格遵循试验方

案规定

3、验证内容：

3.1、培养基来源：

品名

批号

规格

来源

确认人：

确认日期：

3.2、检查用培养基配制方法：

4

培养基名称

配制方法

PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

取本品14.63g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，

15分钟灭菌，备用。

胰酪大豆胨琼脂培养基

取本品40g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。

胰酪大豆胨液体培养基

取本品30.0g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，

沙氏葡萄糖液体培养基

沙氏葡萄糖琼脂培养基

取本品65.0g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，

麦康凯琼脂培养基

取本品50.0g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，

麦康凯液体培养基取本品35.0，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。

3.3、使用仪器

名称型号校验单位有效期至

数显电热恒温培养

数显霉菌培养箱

确认人:

3.4、验证试验用菌种：

菌种名称代号传代代数来源

金黄色葡萄球菌

大肠埃希菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉菌

3.5试验方法：

5

取供试品10ml加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:

10供试液。

需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。

3.6菌液的制备：

3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金

饵，参加胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞

菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物

1ml参加9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，

制成10-1

的菌液，依法10倍稀释至10

～

7

注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基

20ml，

，分取各菌悬液1ml

各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于

100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。

3.6.2取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，参加沙氏葡萄糖液体培养基中置

20～25℃培养箱中培

养24～48h，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物

1ml

参加9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成

10-1的

菌液，依法10

倍稀释至10～7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基

25ml，各菌悬

液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于

100CFU/ml和1000CFU/ml

的菌液备用。

3.6.3取黑曲霉的新鲜培养物接种子沙氏葡萄糖琼脂斜面上，

20-25℃培养5-7天，参加3-5ml含0.05%聚

山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

取1ml参加含0.05%聚山梨酯80的9ml0.9%

无菌氯化

钠溶液中，制成

10-1的菌液，依法10倍稀释至10

～7，取，取菌悬液

注入平皿中，立即倾注沙氏葡

萄糖琼脂培养基

25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，

平皿法培养计数，

取小于100CFU/ml

和1000CFU/ml

3.7需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验：

3.7.1供试液制备：

取供试品10ml，加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:

3.7.2实验条件：

需氧菌培养温度：

30～35℃3～5天

培养箱：

霉菌和酵母菌培养温度：

20～25℃5～7天

3.7.3试验方法：

3.7.3.1

试验组：

3.7.3.1.1

分别取供试液

9.9ml，分别参加0.1ml浓度为1000CFU

的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯

草芽孢杆菌，混匀后取其中

1ml注皿,倾注温度不超过

45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃

或培养箱中培养不超过

3天，计数，每株试验菌平行制备

2个平皿。

3.7.3.1.2

白色念珠菌、黑曲霉菌液，混匀后分别

取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基

20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超

6

过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。

另分别取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄

糖琼脂培养基20ml，置20～25℃或培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。

3.7.3.2菌液对照组：

分别取稀释液9.9ml，分别参加0.1ml浓度为1000CFU的菌液，按试验组操作,倾

注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，置与试验组一样条件下培养,计

数。

每株试验菌平行制备2个平皿。

3.7.3.3供试品对照组：

取供试液1ml，倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂

培养基，置与试验组一样条件下培养,

计数。

每株试验菌平行制备

3.7.4

实验结果

3.7.4.1

结果判定：

试验组的菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在

0.5～2

X围内。

比值=试验组菌落数～供试品对照组的菌落数

*

对照组菌落数

3.7.4.2

需氧菌计数方法适用性试验结果

试验次数：

1

供试品批号:

供试品

菌种类型

试验组

菌液组

比值

对照组

黑曲霉

检验人：

日期：

复核人：

2

3供试品批号:

菌种类型试验组菌液组比值

3.7.4.3霉菌和酵母菌计数方法适用性试验结果

1供试品批号:

2供试品批号:

日期

8

菌种类型试验组菌液组比值对照组

3.7.5结论:

3.8控制菌微生物检测方法适用性试验：

3.8.1实验方法：

3.8.1.1试验组：

取供试液10ml及不大于100cfu大肠埃希菌菌液参加胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃

培养18-24小时,取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24-48小时。

取麦康凯

液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30～35℃培养18-72小时。

试验组应生长良好。

3.8.1.2阴性对照组：

取稀释剂10ml,参加胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18-24小时，阴性

对照应无菌生长。

3.8.1.3阳性对照组：

取不大于100cfu大肠埃希菌菌液参加胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养

18-24小时,取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24-48小时。

取麦康凯液体

培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30～35℃培养18-72小时。

阳性对照组应生长良好。

3.8.2实验结果：

控制菌工程常规法

大肠埃希菌阳性对照组

阴性对照组

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3.8.3结论：

4.方法判定：

本品按?

中国药典?

2021年版〔1105〕、〔1106〕非无菌产品微生物限度检查项下：

“微生物计数法〞

“控制菌检测法〞进展试验。

细菌数测定可用。

霉菌、酵母菌数测定可用。

控制菌，

可用。

5、再验证周期：

当产品的微生物限度检查方法改变、产品组分、工艺改变时，应进展再试验。

6、参考文献：

中国药典2021版

7．结果评价及结论：

验证标准，该适用性试验方法承受。

审核人/日期：

批准人/日期：

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