微生物限度检查法操作规程Word下载.docx

微生物限度检查法操作规程Word下载.docx

《微生物限度检查法操作规程Word下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物限度检查法操作规程Word下载.docx（25页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

2.1.1.2操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。

环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。

操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。

操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。

2.1.1.3缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。

缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。

2.1.1.4洁净级别及检查方法通常采用尘粒数和浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测定方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

洁净级别

尘粒数/m3

浮游菌（个）/m3

沉降菌（个）/（￠90mm·

）

微粒直径≥μm

微粒直径≥5μm

100级

≤3，500

≤0

≤5

≤1

10000级

≤350，000

≤2000

≤100

≤3

100000级

≤3，500，000

≤20，000

≤500

≤10

沉降菌数测定（Ⅱ法）

无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30分钟，将备妥的营养琼脂平板3个（经30℃～35℃预培养48小时，证明无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30分钟后，将盖盖上。

在30～35℃培养箱内倒置培养48小时，取出检查。

3个平板生长的平均菌落数不超过1个。

有条件的单位，同时应检查操作间和净化工作台上的浮游菌和尘粒数，分别应达到10000级和100级。

如菌落数或尘粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤器，必要时予以更换。

2.1.1.5在每次操作前、后用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台、地面及可能污染的死角，然后启动室内的层流净化装置，同时用紫外灭菌灯照射30分钟。

2.1.2阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。

2.1.3无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公室等配套设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。

.1恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（23℃～28℃）、微波炉（或其他适宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆仪（3000～8000r/min）、恒温水浴、离心机、电热干燥箱（250℃～300℃）、电冰箱、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定。

）、菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平、pH系列比色计。

5.2.玻璃器皿、锥形瓶（250～300ml，内装玻璃珠若干；

500ml，1000ml）、培养皿（直径9cm）、量筒（100ml，500ml）、试管（18mm×

180mm、28mm×

198mm）及塞、吸管（1ml分度，10ml分度）、注射器（20ml或30ml）及针头、载玻片、盖玻片、带盖玻璃消毒缸、带盖不锈钢筒。

玻璃器皿用前应用洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。

使用过后如与细菌接触，应先灭菌倒出内容物后再清洗，晾干。

吸管、量筒应不挂水滴，无残留抗菌物质。

吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。

锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用震荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免震荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。

玻璃器皿，均于高压蒸汽121℃灭菌30分钟，烘干或160℃干热灭菌2小时，备用。

2.2.3用具大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%～75%乙醇溶液浸泡）。

无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。

也可用一次性无菌物品。

接种环（白铱金或镍合金，环径4mm～5mm、长度6cm～10cm）、酒精灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、实验记录纸等。

3试液、稀释剂和试剂

试液

3.1.10.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。

5%石碳酸溶液或其他适宜消毒液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）。

75%乙醇溶液。

碘酊或碘伏溶液。

3.2.10.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，121℃灭菌20min。

3.2.2pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，分装过滤，121℃灭菌20分钟。

3.2.3pHg4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20min。

3.2.4pHgg，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20min。

二盐酸二甲基对苯二胺试液取二盐酸二甲基对苯二胺，加水10ml，即得。

临用时少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。

3.3.2亚碲酸钠（钾）试液取亚硫酸钠（钾），加新鲜煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。

3.3.3玫瑰红钠试液取玫瑰红钠，加水使溶解成75ml。

3.3.4亮绿试液取亮绿，加水100ml使溶解。

3.3.5盐酸试液取盐酸，加水稀释成100ml。

3.3.60.1%氯化三苯四氮唑试液（TTC）取氯化三苯四氮唑，加水溶解成10ml。

3.3.7靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。

3.3.8碘试液取碘6g，碘化钾5g，加水20ml使溶解。

3.3.9过氧化氢试液取浓过氧化氢溶液（30%），加水稀释成3%的溶液。

临用时配制。

3.4指示液

3.4.1中性红指示液取中性红，研细。

加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。

变色范围（红→黄）。

3.4.2亚甲蓝指示液取亚甲蓝，加水溶解使成100ml。

3.4.3酚磺酞指示液取亚甲蓝，加1mol/L氢氧化钠溶液，使溶解，再加水至100ml。

变色范围pH6（黄→红）。

3.4.4g，加95%乙醇使溶解成100ml。

色范围pH～6.8（黄→紫）。

3.4.5曙红钠指示液取曙红钠，加水溶解使成100ml。

4.培养基除另有规定外，培养基灭菌条件为121℃20min。

4.1营养琼脂培养基与营养肉汤培养基；

4.2玫瑰红钠琼脂培养基；

4.3酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）；

4.4胆盐乳糖培养基（BL）；

4.5培养基制备注意事项

4.5.1采用干燥培养基，按照说明配制，应对灭菌后的培养基PH值进行校验。

若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。

试剂规格应为化学纯以上。

4.5.2配制的培养基不应有沉淀。

如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。

4.5.3培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。

包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。

4.5.4培养基配制后应在2小时内灭菌，避免细菌繁殖。

4.5.5灭菌后的培养基应保存在2～25℃，防止被污染，可在3周内用毕；

保存于密闭容器中，可在一年内使用。

制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。

4.5.6用水浴或微波炉加热溶化琼脂培养基，勿用电炉直接溶化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏。

已溶化的培养基应一次用完，剩余培养基不宜再用。

培养基不能反复加热溶化。

5.供试品抽样、保存及检验量

5.1抽样

5一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3～5倍量（以备复试或留样观察）。

5抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。

5.1.3凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。

5.2保存

5供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。

5供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。

包装已开启的样品不得作为供试品。

5.3供试品的检验量

5所有剂型的供试品须取自2个以上的包装单位（中药蜜丸须取自4丸、膜剂除须取自4片以上）。

5.3.2固体及半固体（黏稠性供试品）制剂检验量为10g，液体制剂检验量为10ml。

膜剂除另有规定外，中药膜剂为25cm2（中药膜剂较厚不宜取量过多），化学及生化膜剂为50cm2。

贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减。

但除另有规定外，口服固体制剂不得低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。

5.3.3要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。

6.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀桨杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等经传递窗转移至无菌室。

每次实验所用物品必须提前做好计划，准备足够用量，避免操作中出入无菌间。

编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。

6.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30分钟。

6.3关闭紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间换工作鞋。

再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、手套、口罩。

操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，等干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。

7.供试液的制备

按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。

如使用了乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响。

供试液的制备如需水浴加温时，温度不应超过45℃，30分钟。

除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：

7.1液体供试品取供试品10ml，加pHml，混匀，作为供试液。

油剂可先加入适量的（5ml～8ml）无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。

可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。

7.2固体、半固体或粘稠液供试品取供试品10g，加pHml，用匀浆仪（3000r/min～5000r/min，2～4min），振荡器或乳钵研磨等方法分散法混匀，作为供试液。

必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并在水浴中适当加温使供试品分散均匀。

蜜丸等需剪碎，放入匀浆杯。

气雾剂

将供试品置冰箱（4℃～8℃）2h，取出，消毒开启部位周围，以无菌钢锥钻孔并插入容器中，不移出钢锥，以转动方式使容器内抛射剂缓缓全部抛出。

以无菌注射器吸出全部药液，按标示量补加稀释剂至足量（若含非水溶性成分，加适量无菌聚山梨酯-80）混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，再稀释成100ml作为供试液。

合剂（系指含王浆或蜂蜜者，下同）与滴眼剂可直接用供试品作为供试液。

称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加pHml，用匀浆仪（3000r/min～5000r/min，2～4min），振荡器或乳钵研磨等方法分散法混匀。

胃溶胶囊加稀释剂后置45℃±

1℃水浴中振摇。

7.5非水溶性供试品

.1软膏剂、乳膏剂

先将已备妥灭菌的含司盘-805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯-8010g的混合物融化，待冷至45℃时，加入供试品5g（5ml），立即用无菌玻璃棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45℃的pHml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：

20供试液。

7.5.2油剂取供试品10ml加入5ml～8ml无菌聚山梨酯80，摇匀，再加入pHml。

7.5.3栓剂

取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，置45℃水浴保温10min，使溶，加无菌聚山梨酯-805ml～8ml，振摇使乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯-80总量为100ml），摇匀。

7.5.4非水溶性的膜剂供试品

取规定量，剪碎，加稀释剂100ml（必要时可增加稀释剂），置45℃水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试液。

4.5.2.3肠溶胶囊（片）供试品

称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（）100ml的锥形瓶内，于45℃水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试品。

茶剂

取供试品10g，置无菌锥形瓶中，加100ml稀释剂，振摇30s，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：

10加稀释剂，浸泡30min）。

4.5.4以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释剂，制成1：

20～1：

100供试液。

含抑菌成分供试品

供试品如干扰控制菌检验（即按常规检查法，加入规定量的对照菌，阳性对照菌不生长），按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。

稀释法将供试品液放入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。

离心沉淀集菌法取规定量的供试液于刻度离心管中，离心（3000r/min）30min，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定量的供试液。

如有不溶性药渣，可先离心（500r/min）5min，取全部上层液，再行集菌处理。

4.5.5.3薄膜过滤法

取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于μμm微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50ml～100ml，取出滤膜备检。

4.5.5.4中和法

凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。

如含磺胺类的供试品，加入100ml对氨基苯甲酸的增菌液中；

含汞、砷类的供试品，加入硫乙醇酸盐培养基100ml中；

含洗必泰的供试品，加入含聚山梨酯-80等表面活性剂的100ml增菌液中（表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用）。

沉降法取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。

4.6试验前的准备

将供试品及所有已灭菌的物品及稀释剂等移至无菌室内。

每次试验所用物品必须事先准备足够用量，避免操作中出入操作间。

开启无菌室紫外洒和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。

操作人员用肥皂洗手，关闭紫外灯，进入更衣室，换工作鞋。

再用消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。

操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。

检查法

细菌、霉菌与酵母菌计数

平皿菌落计数法

供试液的稀释

取2～3支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂（注意：

勿在乙醇灯焰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）。

加完稀释剂后，试管塞应立即塞上。

另取一支1ml灭菌吸管吸1:

10供试液1ml，加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中混匀，即为1:

以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:

102、1:

103、1:

104等适宜稀释级（至少共3级）。

每递增1稀释级，必须另换一支吸管。

在做10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面，反复吸吹约10次。

吸液时，应先吸至高于所需刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第二级稀释管的内壁靠近液面但不接触液面处缓缓吹出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。

4.7.1.1.2注皿

在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释液各1ml至每个平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可不换吸管），每一稀释级注2～3个平皿，注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体。

将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼脂）溶化，冷至约45℃时，倾注上述各个平皿约15ml，立即快速旋转平皿混匀，混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上，然后置操作台上待凝。

4.7.1.1.3培养

凝固后，将细菌计数平板倒置于30℃～35℃培养箱中培养48h。

霉菌、酵母菌计数平板于25℃～28℃培养箱中培养72h。

4.7.1.1.4菌数测定阴性对照

取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。

菌落计数

一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。

勿漏计琼脂层内细小的各平皿边缘生长的菌落。

注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的鉴别。

必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。

为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加1～2个平皿注皿，注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。

或用0.001%TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。

供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不应点计在内。

排除的方法需按该制剂微生物药品而定，并须观察菌落特征及染色形态。

若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；

若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界线，一条链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。

记录各稀释级平板的菌落数，求出各稀释级2或3个平板菌落的平均数。

当菌落数在15个以上的同稀释级二平板菌落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；

当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，两下平板菌落数的差值允许范围为0～4、1～7、2～9、3～10、4～12、5～14、6～15。

超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。

有下列情况者，点计菌落时间需提前或延长培养时间：

a）菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在24h，霉菌点计需在48h做初步点计（点计霉菌菌落时，动作宜轻，勿反复翻转平板或造成震动，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。

b）在48h点计细菌，72h点计霉菌时，菌落极小不易辨认，需延长培养时间4h～7h，再点计菌落数。

c）对有疑义的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。

供试品按营养琼脂平板点计细菌菌落数；

固体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌数，一般液体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数及酵母菌总数；

含蜂蜜及王浆的合剂按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数，按YPD琼脂平板点计酵母菌菌落数，两者合并为霉菌及酵母菌数。

点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

菌数报告规则

细菌数宜选取平均菌落娄在30～300的稀释级，霉菌、酵母菌宜选取平均菌数在30～100的稀释级在30～100的稀释级作为报告菌数。

如有1个稀释级在30～300（30～100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告（见表1例①）。

如同时有2个相邻稀释级在30～300（30～100）之间时，按下式计算两级比值。

当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2时，以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表1例②）。

如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30～300时，以后2个稀释级计算级间比值报告（见表1例③）。

如各稀释级的平均菌落数均不在30～300，以最接近30或300的稀释级乘以稀释倍数报告（见表1例④）。

如各级稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表1例⑤）。

如各各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表1例⑥）。

如各稀释级均无菌生长或最低稀释级平均菌落数小于1，应报告菌数为＜10个/g或ml（见表1例⑦）。

如当1:

10（或1:

100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1:

10）稀释级时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数（见表1例⑧）。

表1细菌数报告规则举例

规则

原液

各稀释级菌落数

比值

菌落数

报告数

1:

10

100

1000

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

19

1365

2760

2890

239

236

不可计

26

0.5

31

164

295

271

202

196

305

4650

16

20

46

60

35

42

12

513

11

－

16400

37750

27100

27600

19600

30500

513000

260

5

﹡

16000

38000

27000

28000

20000

30000

510000

＜10

﹡培养基稀释法

4.7.1.2培养基稀释法

取供试液（原液或1:

10供试液）3份。

每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿内（每皿各或）。

每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。

每1ml注入的5个或5个以上平皿点计的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组数据。

以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。

4.7.1.3结果报告

4.7.1.3.1菌落数在100以内时，按其数据报告。

菌落数大于100时，取两样有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。

复试

供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。

细菌、霉菌和酵母菌形态特征比较，见表2。

表2细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较

（营养琼脂及玫瑰红钠琼