微生物限度检查法标准操作规程参考WordWord文档下载推荐.docx

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4.2检验规程

4.2.1微生物限度检查法总则

4.2.1.1微生物限度检查法系指检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的方法。

检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌的检查。

4.2.1.2微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。

4.2.1.3供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。

4.2.1.4除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为23

℃～28℃，控制菌培养温度为35～37℃。

4.2.1.5检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。

4.2.2供试品的检验量：

检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。

除另有规定外，一般供试品检验量为10g或10ml；

中药膜剂为50cm2,贵重药品、微量包装药品检验量可以酌减。

要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。

一般应随机抽取不少于检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。

4.2.3供试液的制备

按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制备供试液。

供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

4.2.3.1液体供试品取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：

10的供试液。

油剂可加适量无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。

水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

4.2.3.2固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g,加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其它适宜方法，混匀，作为1：

必要时可加适量聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

4.2.3.3具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。

（1）培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。

测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。

每1ml供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；

控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。

（2）离心沉淀集菌法取一定量的供试液，离心（3000转）20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清夜再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。

（3）薄膜过滤法滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm。

选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。

滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。

使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试品过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。

油类供试品的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。

用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。

为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。

供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。

每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。

若

供试品每1g或1ml所含脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。

每种培养基至少制备一张滤膜。

（4）中和法凡含汞、砷类或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。

中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

4.2.4对照用菌液

控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验。

对照菌株为大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、大肠菌群、沙门菌〔CMCC（B）50094〕。

取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的

菌悬液。

4.2.5检查法

4.2.5.1细菌、霉菌与酵母菌计数

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。

检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。

取按验证的方法制备的均匀供试液，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：

10、1：

102、1：

103等稀释级。

4.2.5.1.1平皿法采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。

取供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

阴性对照试验取试验用的稀释剂1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。

每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

培养和计数除另有规定外，细菌培养48小时,分别在24及48小时点计菌落数,一般以48小时菌落数报告。

霉菌、酵母培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时菌落数报告；

必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数并报告。

菌落如蔓延生长成片的平板不宜计数。

点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数；

玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。

在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌及酵母菌、细菌菌落数。

然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。

含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。

菌数报告规则宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间的稀释级,霉菌宜选取平均菌落数在30～100之间的稀释级作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。

（1）当仅有1个稀释级菌落数在30～300（30～100）之间时,将该稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

（2）当同时有2个稀释级在30～300（30～100）之间时，按下式计算两级比值。

高稀释级的平均菌落数×

稀释倍数

比值＝────────────────

低稀释级的平均菌落数×

当比值≤2时，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；

当比值＞2但不超过5时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；

当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。

（3）当各稀释级平均菌落数均小于30时，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。

（4）各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落

数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

4.2.5.1.2薄膜过滤法见4.2.3.3中“薄膜过滤法”

阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，照薄膜过滤法操作，作为阴性对照。

阴性对照不

得有菌生长。

培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。

菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；

若滤膜上无菌落生长，以

＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数。

4.2.5.2控制菌检查

供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。

阳性对照试验进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。

阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，方法同供试品的控制菌检查。

阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。

阴性对照应无菌生长。

（1）大肠埃希菌（Escherichiacoli）取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm

2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。

取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。

若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；

不呈现荧光，为MUG阴性。

观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；

呈试剂本色，为靛基质阴性。

本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；

如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；

如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出

大肠埃希菌。

若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。

表1大肠杆菌菌落形态特征

───────┬──────────────────

培养基│菌落形态

───────┼──────────────────

曙红亚甲蓝琼脂│呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，

│菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆

│形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿

│润，常有金属光泽。

麦康凯琼脂│鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，

│圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

───────┴──────────────────

（2）大肠菌群（Coliform）取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1：

10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1：

100的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml）、1：

1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支胆盐乳糖发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。

培养18～24小时。

胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；

若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；

若平板上生长的菌落与表2所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确认试验。

表2大肠菌群菌落形态特征

曙红亚甲蓝琼脂│呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，

│圆形，扁平或稍凸起，

│边缘整齐，表面光滑，湿润。

麦康凯琼脂│鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或

│稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。

确证试验从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24～48小时。

若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。

根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或1ml供试品中的大肠菌群。

表3可能的大肠菌群数表

各供试品量的检出结果

可能的大肠菌群数N

（个/g或ml）

0.1g或0.1ml

0.01g或0.01ml

0.001g或0.001ml

+

—

＞103

102＜N＜103

10＜N＜102

＜10

注：

+代表检出大肠菌群；

—代表未检出大肠菌群。

（3）沙门菌（Salmonella）取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18～24小时。

取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门氏、志贺氏菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养18～24小时（必要时延长至40～48小时）。

若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出沙门菌。

若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；

或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。

否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。

表2沙门氏菌菌落形态特征

───────┬────────────────────────────

　培养基　│菌落形态

───────┼────────────────────────────

胆盐硫乳琼脂　│无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。

沙门、志贺　│无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色。

菌属琼脂　│

曙红亚甲蓝琼脂│无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落。

麦康凯琼脂　│无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。

───────┴────────────────────────────

4.2.6结果判断

供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试，即应判该供试品不合格。

供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定时，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以三次结果平均值报告菌数。

眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，，须以二次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。

若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下规定，应判供试品符合规定；

若其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不符合规定。

4.2.7培养基及其制备方法

4.2.7.1营养琼脂培养基

取营养琼脂培养基34g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

4.2.7.2玫瑰红钠琼脂培养基（虎红琼脂培养基）。

取玫瑰红钠琼脂培养基30g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

4.2.7.3胆盐乳糖培养基（BL）

取胆盐乳糖培养基36g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分

钟。

4.2.7.4麦康凯琼脂培养基（MacC）

取麦康凯琼脂培养基54g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

4.2.7.54-甲基伞形酮葡萄苷酸培养基（MUG）

取4-甲基伞形酮葡萄苷酸培养g，加1000ml蒸馏水，分装，115℃高压灭菌20分钟。

4.2.7.6曙红美亚甲蓝琼脂培养基（EMB）

营养琼脂培养基100ml2％曙红溶液2ml

20％乳糖溶液　　　　5ml0.5％亚甲蓝溶液1.3～1.6ml

取营养琼脂培养基，加热融化后，冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其它三种溶液,摇匀，倾注平皿。

4.2.7.7三糖铁琼脂培养基（TSI）

胨20g硫酸亚铁0.2g

牛肉浸出粉5g硫代硫酸钠0.2g

乳糖10g0.2％酚红溶液12.5ml

蔗糖10g琼脂12～15g

葡萄糖1g水1000ml

氯化钠5g

除三糖、0.2％酚红溶液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±

0.1，加入琼脂，加热融化后，滤过，再加入其余成分，摇匀，分装,115℃灭菌30分钟，制成高底层（2～3cm）短斜面。

4.2.7.8四硫磺酸钠亮绿增菌液（TTB）

胨5g硫代硫酸钠30g

牛胆盐1g水1000ml

碳酸钙10g

取上述成分，混合，微温使溶解，121℃灭菌20分钟。

临用前，取上述培养基，每10ml中加入碘溶液（取碘6g与碘化钾5g，溶于20ml水中）0.2ml和0.1％亮绿溶液0.1ml，混匀。

4.2.7.9沙门、志贺菌属琼脂培养基（SS）

胨5g硫代硫酸钠8.5g

牛肉浸出粉5g　　　　1％中性红溶液2.5ml

乳糖10g　　　　0.1％亮绿溶液0.33ml

牛胆盐8.5g　　　　琼脂20g

枸橼酚钠8.5g水1000ml

枸橼酸铁铵1g

除糖、指示剂、琼脂外，取上述成分混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±

0.1，滤过，加入琼脂，加热融化后，121℃灭菌20分钟，再加入其余成分，摇匀，冷至约60℃，倾注平皿。

4.2.7.10胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）

胨20g枸橼酸钠1g

牛肉浸出粉3g枸橼酸铁铵1g

乳糖10g1％中性红溶液3ml

蔗糖10g琼脂18～20g

去氧胆酸钠1g水1000ml

硫代硫酸钠2.3g

除糖、1％中性红溶液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±

0.1，加入琼脂,加热融化后,再加入其余成分，摇匀，冷至约60℃，倾注平皿。

4.2.7.11酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）

胨10.0g琼脂14.0g

酵母浸出粉5.0g水1000ml

葡萄糖20.0g

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖，分装，灭菌。

4.2.7.12胆盐乳糖发酵培养基

取未灭菌的胆盐乳糖培养基1000ml，加入0.04%溴甲酚紫指示液25ml，根据要求的用量分装于含倒管的试管中。

灭菌。

所用倒管的规格应保证产气结果的观察。

均使用成品脱水培养基。

4.2.8试液

4.2.8.1靛基质试液

配制：

取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，加滴边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深；

或取对二甲氨

基苯甲醛1.0g，加入乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。

4.2.8.2溴甲酚紫指示液

取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇使溶解成100ml。

4.2.9稀释剂

4.2.9.10.9%无菌氯化钠溶液

取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌。

4.2.9.2PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

取磷酸二氢钾3.56g与磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

4.2.10指示液

4.2.10.1甲基红指示液

取甲基红0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。

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