人感染H7N9禽流感病毒PCR检测操作程序Word格式文档下载.docx
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按试剂、仪器说明书完成加样和反应管准备。
（四）扩增检测
扩增检测在扩增区进行。
待检管转移至扩增区，按顺序置于仪上，编辑样本信息，按试剂和仪器说明书设定循环参数。
（五）结果分析
根据所用试剂盒说明书设置基线值（）。
荧光阈值（）设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点为原则，且值应大于所设置的扩增循环数（或显示为）。
使用仪器配套软件自动分析结果。
（六）质量控制
检测过程对可能出现的假阳性和假阴性进行质量控制，除了检测商品试剂盒所提供阳性和阴性对照外，每次临床样本检测时，至少应当有份弱阳性和份阴性质控样本（多份阴性质控样本设置对实验室“污染”所致假阳性的监控更为有效），随机放在所检测标本的中间。
弱阳性质控样本可为检测阳性的灭活稀释后保存的临床样本、灭活病毒或假病毒颗粒等，如所采用的商品化试剂盒有“内标”控制假阴性，或弱阳性质控样本来源困难，可暂不设弱阳性质控。
阴性质控样本采用标本采集管内溶液即可。
质控样本应与临床标本同等对待，参与样本核酸提取和扩增检测全过程。
试剂盒中的阳性和阴性对照用于判断实验室的有效性，按试剂盒说明书进行。
（七）实验结果的判定与解释。
按照试剂盒说明书进行。
对于出现弱阳性结果的样本应进行重复检测，并注意与可能的实验室轻度或样本交叉“污染”所致假阳性结果区别。
五、检测结果报告
六、其它注意事项
（一）人感染禽流感病毒实验室活动、样本采集和运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。
从事人感染禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训并具备相应的实验技能，在检测过程中必须采取生物安全防护措施（使用眼罩、型口罩等）。
样本核酸提取必须在Ⅱ级生物安全实验室，经过年检合格的二级生物安全柜内进行。
实验室应具有良好的通风。
（二）注意仪器设备的日常和定期维护，加样器、扩增仪和温育设备应进行定期校准。
试剂盒及一次性使用的无酶和酶反应管、离心管、带滤芯吸头等应进行每批质检。
（三）实验应严格分区操作；
各区物品、工作服等均应当专区专用，不得交叉使用。
实验后应及时清洁工作台，以防污染。
（四）每批实验室后，可采取实验室通风、次氯酸钠溶液擦洗地台面、紫外照射等措施，消除可能存在的扩增产物气溶胶污染。
（五）使用中国疾控中心制备试剂开展检测工作时，可参考相应试剂盒说明书（见附件、）有关要求。
附件：
亚型禽流感病毒检测试剂盒（荧光法）说明书
禽流感病毒核酸检测试剂盒（荧光探针法）说明书
亚型禽流感病毒检测试剂盒
（荧光法）说明书
【产品名称】
通用名称：
亚型禽流感病毒检测试剂盒（荧光法）
英文名称：
（）
【包装规格】人份盒。
【预期用途】
本试剂用于对咽拭子样本中亚型禽流感病毒进行定性检测，用于禽流感病毒感染的辅助诊断及流行病学监控。
【检验原理】根据荧光技术原理，针对亚型禽流感病毒的基因和基因设计特异性引物和探针，通过荧光检测仪进行检测，从而实现对亚型禽流感病毒的定性检测。
试剂盒以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶（）的为正常人体细胞对照，对提取和检测过程进行监控。
【主要组成成分】
名称
成分
规格
数量（管）
反应液
含内标、亚型特异基因的引物探针混合液
管
聚合酶
聚合酶，不可用其他同类聚合酶替代
μ管
逆转录酶
逆转录酶，不可用其他同类逆转录酶替代
阳性对照
、、假病毒混合物
阴性对照
水
本品各组成成分均不得与其他产品或不同批号产品中的相应组成成分进行互换。
本品不包含，但对实验必须的设备和试剂：
生物安全柜、台式离心机、旋涡震荡器、拭子、采样管、无菌病毒采样液、无核酸酶的离心管、全自动荧光检测仪专用扩增管和核酸分离试剂盒（硅胶膜吸附法，北京金豪制药股份有限公司，：
）。
【储存条件及有效期】-20℃冷冻保存，有效期个月，阳性对照反复冻融次数不得超过次。
【适用仪器】、、、型全自动荧光检测仪。
【样本要求】
.样本类型：
咽拭子。
推荐使用金豪公司生产的微生物采样及运送管（人份盒）。
.拭子、采样管和保存液：
拭子选择：
应使用头部为合成纤维（例如，聚酯纤维），杆部为铝或塑料的拭子。
采样管：
外螺旋口、耐-70℃冻存，可容纳病毒采样液。
无菌病毒采样液：
应含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生产的抗生素，缓冲液，经无菌处理。
.样本采集、运输和保存：
由于亚型禽流感病毒为呼吸道传播病毒，有关生物安全应按照“《人间传染的病原微生物名录》”中高致病性禽流感病毒进行管理。
采集：
采集病人发病日内的咽拭子标本，用于病原检测。
用微生物采样及运送管内的采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；
迅速将棉签放入装有保存液的外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
4℃暂存并在小时内送达实验室。
保存和运输：
新鲜采集样本应在4℃条件下小时运送到检测实验室。
保存样本可在-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。
冷冻样本应在冷冻条件下送至实验室。
运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持标本采集管直立状态，不能倾斜。
样本送至实验室后，立即进行处理和分装，避免反复冻融。
临床样本保存在4℃不能超过天。
.咽拭子标本的处理
咽拭子要在标本保存液中充分搅动（至少下），以洗脱拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。
然后在4℃条件下，离心分钟，用上清接种细胞或直接提取。
如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。
【检验方法】
.核酸提取：
取μ咽拭子样本进行核酸提取。
采用北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒（硅胶膜吸附法），该试剂盒可用于对呼吸道悬浮液样本中的病毒提取，并按试剂盒说明书要求操作。
本品的阳性对照和阴性对照均参与核酸提取。
.准备及注意事项：
1.1.1分别在洗液瓶和洗液瓶中加入和无水乙醇，颠倒充分混匀，并在瓶身上加以标识。
1.1.2吸取所需的洗脱液，加至一无核酸酶的管中，于70℃预热。
1.1.3冷冻样本应室温融化，轻微震荡混匀后使用。
1.1.4区分操作中的离心设置（和），本产品操作过程均为室温离心。
1.1.5助沉剂在低温保存时可能呈胶状，吹打混匀即可使用。
.样本裂解及核酸吸附
1.2.1在无核酸酶的离心管中加入μ助沉剂和μ裂解液，加入μ待处理样本，剧烈震荡分钟，室温静置分钟。
注：
如样本体积小于或大于μ，需按比例改变助沉剂、裂解液以及无水乙醇体积。
体积大于μ样本应分多次进行处理。
1.2.2加入μ无水乙醇，颠倒混匀，吸取μ裂解混合物转移到核酸吸附柱中。
如样本体积小于或大于μ，需按比例改变乙醇用量。
3500g离心分钟，取下套管，倒掉套管中的液体。
将剩余裂解混合物转移至核酸吸附柱，重新离心一次，弃套管中的液体。
1.2.4将核酸吸附柱重新装入套管，6000g离心分钟，倒掉套管中的液体。
.核酸纯化
1.3.1将核酸吸附柱重新装入套管，在核酸吸附柱中加入μ洗液，6000g离心分钟，将核酸吸附柱装入一个干净套管中。
1.3.2在核酸吸附柱中加入μ洗液，静置分钟，6000g离心分钟。
1.3.3倒掉套管中的液体，将核酸吸附柱重新装入套管。
1.3.4重复一次步骤（本步骤不用静置分钟）。
1.3.5将核酸吸附柱换一新套管，离心分钟。
.核酸洗脱
1.4.1将核酸吸附柱装入一无核酸酶离心管，小心在吸附膜中央加入μ预热洗脱液，室温静置分钟。
离心分钟，离心管中液体即待测样本。
.扩增：
实验设计：
2.1.1待检样本检测：
每份样本分别使用种反应液（和反应液）进行检测，综合种反应液的检测结果对样本进行判定。
2.1.2对照品检测：
每次实验都应设置阴性对照和阳性对照。
反应体系的配制：
2.2.1准备工作：
将种反应液（和反应液）融化后振荡混匀，离心秒。
2.2.2种反应体系（和）的配制：
取个无核酸酶离心管，计算待测样本数量（），分别取μ×
（）反应液（和）、μ×
（）聚合酶和μ×
（）逆转录酶充分混匀，离心秒。
份样本份阳性对照份阴性对照；
反应体系分管：
每份待测样本设置个扩增管（和），分别将每种反应体系按μ管分装至对应的扩增管中。
加样：
每份待测样本、阳性对照、阴性对照以μ管分别加入个扩增管中。
扩增检测：
将加样后的扩增管分别转移到全自动荧光定量检测仪上进行扩增检测，不同仪器的设置如下：
2.5.1全自动荧光定量检测仪（、、型）扩增程序：
对于、型全自动荧光定量检测仪，荧光信号设置为：
：
、，：
，：
。
其他型号仪器可设置为和通道。
荧光扩增程序的设置见表。
反应总体积为μ。
表.荧光扩增程序
步骤
反应温度
时间
是否采集光
循环数
逆转录及变性
50℃
分钟
否
95℃
预扩增
秒
72℃
扩增及荧光收集
55℃
是
2.5.2全自动荧光定量仪（系列）扩增程序：
选择、通道收集荧光。
荧光扩增程序见表。
是否采集荧光
93℃
.结果分析：
本品荧光探针的报告荧光为，荧光探针的报告荧光为，荧光探针的报告荧光为。
所以应选择通道和通道分析实验结果。
基线（）范围根据仪器要求设定，目的为校正背景荧光干扰，终止循环（）一般设置为最强样本出现扩增信号的前个循环。
阈值线用于判断样本是否扩增，应调整使阈值线高于荧光背景和阴性对照的荧光信号，或点击分析（）自动获得。
.质量控制：
每次实验应设置阳性对照和阴性对照，且应符合以下要求，否则实验结果不成立。
阴性对照无值或值为。
阳性对照值小于。
【参考值（参考范围）】
值≤报告该反应阳性；
无值或值为报告该反应阴性；
＜值＜为灰区；
内标有效的范围为：
＜值＜；
【检验结果的解释】
.在内标结果成立的条件下各种判读模式如下：
模式
结果判断
亚型禽流感病毒阴性
亚型禽流感病毒阳性
在内标结果不成立的条件下视为检测异常，应重新采样检测。
.结果在灰区的样本需重复实验：
取μ样本重新提取（核酸分离试剂盒中裂解液、无水乙醇的用量加倍，其他组分的用量不变）并检测。
复检结果＜的样本为阳性，否则为阴性。
.内标检测靶物质为正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶（）的，用于对样本中的提取和扩增检测过程进行有效监控。
如果该份样本的检测值≥，可能为以下原因：
未采集到足够的正常人上皮细胞，应重新采样。
核酸提取过程异常，导致损失，应重新提取。
样本中存在抑制物质，可稀释后检测；
【检验方法的局限性】
.样本中浓度低于本产品的最低检出值（）时可能出现假阴性。
.目前研究显示，发病后两日内取样检测，病毒检出率最高，随发病时间的延长，病毒被清除，病毒核酸的检出水平迅速下降。
因此应在发病后尽早采样，必要时可采用多部位取样检测。
临床评价应结合其他临床症状和实验室检测指标进行判断。
【产品性能指标】
.本品可最低检出稀释物。
.本品对季节性流感（以及）灭活病毒、型流感灭活病毒、高致病性禽流感灭活病毒（）进行检测，结果为阴性。
【注意事项】
.开始检测前请仔细阅读本说明书全文，并严格按照要求进行操作。
.实验室配置和实验操作请按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》进行；
整个检测过程应严格分区进行：
反应体系的配置区；
标本处理、加样区；
各区使用的仪器、设备、耗材和工作服应独立专用。
亚型禽流感为经呼吸道传播疾病，应按照相关要求进行。
样本的采集、处理、运输和保存均存在一定生物危害。
样本的采集、运输和保存应按照乙类传染病进行管理；
标本的提取必须在生物安全二级实验室的负压生物安全柜中完成；
实验中接触过标准品和对照品的废弃物品（如吸头）、扩增完毕的离心管、标本等应进行无害化处理后方可丢弃。
.不同批号的试剂请勿混用，请在有效期内使用试剂盒。
.本产品仅用于体外诊断检测。
【参考文献】
.微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（）
.《人感染禽流感诊疗方案（年第版）》
.《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[]号）
【生产企业】
企业名称：
北京金豪制药股份有限公司
生产地址：
北京市北京经济技术开发区运成街号
注册地址：
北京市北京经济技术开发区运成街号号楼
邮政编码：
电话号码：
传真号码：
网址：
【医疗器械生产企业许可证编号】京药监械生产许号
禽流感病毒核酸检测试剂盒
（荧光探针法）说明书
【产品名称】通用名称：
禽流感病毒核酸检测试剂盒（荧光探针法）
（）
【包装规格】大包装，反应盒
流感病毒可分为甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。
其中，甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白（）的不同可分为种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白（）的不同可分为种亚型，不同亚型可以与的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。
而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，禽流感病毒是其中的一种。
流感病毒既可以感染禽类，也可以感染人。
人感染禽流感会出现严重肺炎，症状包括发烧、咳嗽、呼吸困难等。
本试剂盒适用于检测呼吸道样本、血清、肺组织等样本中禽流感病毒，可用于该病毒感染的实验室诊断和宿主动物的监控。
检测结果仅供研究，不用于临床诊断。
【检验原理】
本试剂盒基于实时荧光技术，分别选取禽流感病毒的基因和基因保守区作为扩增靶区域，设计特异性引物探针，通过一步法实时荧光体系扩增对禽流感病毒进行定性检测。
反应体系中除特异性引物和特异性荧光探针外，还配以对应的反应、逆转录酶、酶、核苷酸单体（）、等成分，可实现对禽流感病毒核酸灵敏特异地检测。
组分名称
数量
检测试剂
反应液
µ
内标溶液
质控品
阴性质控品
阳性质控品
【储存条件及有效期】保存于±
5℃，反复冻融次数＜次，有效期个月。
【适用仪器】、、等荧光定量仪。
适用样本类型：
呼吸道样本、血清、肺组织。
样品采集、保存与运送。
标本采集、保存、运送请遵循《人感染禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》。
.核酸提取
建议取µ
液态样本进行核酸提取；
组织样本可以研磨液进行提取操作。
可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒，请按照试剂盒说明书进行操作；
也可选择其他合适的商业化产品。
本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，若提取试剂盒中未说明内标的使用方法可在每µ
样本中加入µ
内标溶液后进行核酸提取。
本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；
阳性质控品不参与提取，用于检测试剂的质控。
扩增（仪器操作为例，、等仪器参照此操作及仪器操作手册）
分别配制反应体系和反应体系
反应体系配制
取适量反应管（按反应体系计算）；
每管加入反应液µ
、反应液µ
（也可按照单个反应的用量，计算反应液、各自所需总量，两者混匀后分装µ
于单个反应管中）。
于上述反应管中分别加入处理后的阴性质控品、阳性质控品、待测标本核酸各µ
，离心数秒，放入扩增仪。
探针检测模式设置为：
反应条件设置为：
50℃，个循环；
95℃分钟，个循环；
94℃秒→58℃秒（收集荧光），个循环。
保存文件，运行。
.结果分析
反应结束后保存检测数据文件。
分析条件设置：
根据分析后图像调节的值、值以及的值（用户可根据实际情况自行调整，值可以在～、值可设在～，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击自动获得分析结果，在界面察看结果。
【质量控制】
阴性质控品：
检测通路扩增曲线无对数增长期，检测通路扩增曲线为明显对数增长期；
阳性质控品：
检测通路扩增曲线有明显对数增长期，且检测通道扩增曲线值≤；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
【结果判定】
.如果检测样品的及反应体系检测通道均无扩增曲线或值＞，且在检测通道均有对数增长期，可判样品为禽流感病毒阴性；
.如果检测样品的及反应体系扩增曲线在检测通道均有对数增长期且检测通道值≤；
可判样品为禽流感病毒阳性；
.如果检测样品的或反应体系仅其中之一的扩增曲线满足判为阳性的要求，则需重复检测；
若重复检测结果为及均阳性，则判禽流感病毒阳性；
若重复检测结果仍为（或）阳性，则只能判禽流感病毒（或）亚型阳性，并建议以其他方法做进一步确认。
【检测方法的局限性】
.样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关。
.样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。
.病毒在流行过程中的基因突变则也可能导致假阴性结果。
.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取试剂进行样本处理时核酸提取效率存在一定差异，本试剂盒推荐使用本公司生产的核酸提取试剂盒（离心柱法），用户可根据具体要求进行选择确认。
.本检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段.
根据产品分析性能评估结果，本试剂盒的分析灵敏度为×
与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体（甲型流感病毒亚型、甲型流感病毒亚型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感亚型病毒、禽流感亚型病毒等）无交叉反应。
.实验室管理应严格按照基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
.为试剂和标本准备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
.试剂使用前要完全解冻，离心数秒后使用；
.标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；
.实验完毕用次氯酸或酒精或紫外线灯处理工作台和移液器；
.本试剂盒内阳性质控品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：
卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
【生产企业】企业名称：
中山大学达安基因股份有限公司
广州市高新技术产业开发区香山路号；
广州市高新技术产业开发区荔枝山路号
邮编：
电话：
、
传真：
【医疗器械生产企业许可证编号】粤食药监械生产许号
人感染禽流感病毒核酸检测
实验室生物安全保障基本要求
为加强人感染禽流感病毒核酸检测规范化管理，做好实验室生物安全管理工作，根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第号令，以下简称《管理条例》）、《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部号令，以下简称《管理规定》）等有关要求，制定本标准。
供医院开展人感染禽流感病毒核酸检测时参考使用。
一、样本采集
（一）进行人感染禽流感病毒相关样本（以下简称“样本”）采集的操作人员必须经过生物安全培训合格，并具备相应的操作技能。
（二）样本采集过程中，操作人员要加强防护，应当穿戴防护服、眼罩、及以上水平的医用防护口罩、双层医用乳胶手套、帽子等个体防护装备。
（三）用于样本采集的主容器必须采用优质塑料材质，且大小适合、带螺旋盖、内有垫圈、无菌、耐冷冻的密闭容器。
样本采集后，主容器盖必须盖严、拧紧，表面应当擦拭消毒。
（四）对诊疗过程中采集的各种临床样本，医疗机构应当加强生物安全管理，在进行动态风险沟通与评估基础上，采取样本登记造册、专库存放、专人负责以及必要的消毒处理等较严格的安全及安保管理措施。
（五）样本采集过程中产生的医疗废物要分类收集，应当在产生地点进行压力蒸汽灭菌或可靠的化学消毒，然后按感染性、损伤性等医疗废物收集处置。
二、样本包装和运输
（一）
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