细胞工程实验动植物组织培养Word文档下载推荐.docx

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（1）

大量元素（×

20）

KNO338g

NH4NO333g

CaCl26.45g（单独溶解）

MgSO4·

7H2O7.4g

K2HPO43.4g

（2）微量元素（×

200）

碘化钾0.166克

微量元素中的硫酸铜、钼酸钠和氯化钴用量太少，无法称量，可以先称取10倍量配成100ml溶液，再取其中10ml即可。

和其他成分一起定容到1000ml。

硼酸1.24克

硫酸锰4.46克

硫酸锌1.72克

钼酸钠0.05克

硫酸铜0.0025克

氯化钴0.0025克

两种物质分别用400ml水单独溶解，然后将二者混合，定容到1000ml即可。

（3）铁盐（×

EDTA-Na27.46克

硫酸亚铁5.56克

（4）有机（×

维生素B10.1克

维生素B60.02克

肌醇20克

烟酸0.1克

甘氨酸0.4克

（5）激素

称取50mg6-BA，加少量盐酸（或乙醇），溶解后用蒸馏水定容到50ml。

称取50mgNAA，加入少量1M氢氧化钠溶液（或乙醇），溶解后用蒸馏水定容到50ml。

（思考：

为什么6-BA要用盐酸溶解，而NAA要用氢氧化钠溶解。

）

注意：

配制培养基母液时，试剂瓶要洗干净、烘干备用。

实验二、培养基的配制、灭菌以及愈伤组织的诱导

1.了解培养基母液以及培养基的配方法和过程。

3.掌握接种时外植体的消毒和接种的方法。

4.理解细胞的全能性理论。

利用植物细胞全能型的理论，将植物组织离体培养，通过人工培养环境的诱导，使细胞恢复分生的状态，再用激素诱导，使植物组织重新分化成器官。

直至长出新的植物幼苗。

1000ml的大烧杯、玻璃棒、电炉、高压灭菌锅、酒精灯、镊子、解剖刀、解剖盘、打火机、培养皿、滤纸

大量元素母液，微量元素母液，有机元素母液，铁盐母液、蔗糖、生长素（NAA）溶液、细胞分裂素（6-BA）溶液、琼脂pH试纸、氢氧化钠（1N）、盐酸（1N）、无水酒精、75%酒精植物材料

1.培养基的配制:

取大量元素母液50ml，微量元素5ml，有机元素5ml，铁盐5ml。

（为什么取这一个量？

）。

加入800ml左右的水，琼脂7.5克在电炉上煮到沸腾，到琼脂全部融化（液体澄清，无块状琼脂存在），加入蔗糖30克，搅拌均匀，加入激素6-BA0.5ml，2，4-D0.5ml。

调pH到5.8。

然后分装到150ml锥形瓶中，塞好棉塞，包瓶口。

每瓶培养基分装50ml为好。

3.培养基灭菌

将分装好的培养基和实验中所要用到的工具（镊子、解剖刀、培养皿、烧杯等）和蒸馏水一起放入高压灭菌锅进行加热。

当气压达到0.05Mpa时，打开放气阀放出冷气。

为什么？

），当气压回到0时，关闭放气阀加热。

当气压达到0.1M大气压时，计时20分钟（保持温度在121度~126度之间）。

然后等气压降低到0.05Mpa时，放气，打开灭菌锅，取出培养基和工具，冷却备用。

4.取材和接种

（1）取材：

应取植物的幼嫩叶片或者叶柄。

尽量去掉生长态势不好的组织。

（2）外肢体消毒：

将取下的材料用自来水冲洗20分钟，洗去灰尘，放入超净工作台，用75%的酒精消毒30秒（切忌时间过长，为什么？

），再用无菌水洗涤一次，倒入升汞，消毒3~5分钟，取出材料，用无菌水清洗3次以上。

（3）接种：

将消毒好的材料进行剪切，去掉灭菌时叶片切口接触消毒试剂的部分（为什么？

），将材料切成4×

4mm2的小块。

平整的放置在培养基的表面。

（不要放入培养基内部，为什么？

（4）培养：

将接种好的材料放入光照培养箱中进行培养。

5.思考题：

（1）灭菌的时候，为什么要先将冷气放掉？

（2）外植体是越大越好还是越小越好，为什么？

（3）接种的时候怎样才能保证无菌？

（4）为什么接种时先要将材料洗涤3次以上？

实验三、组织愈伤组织增殖

掌握.了解植物激素对植物愈伤组织培养中的作用和激素使用的原则。

二、实验原理：

在植物愈伤组织分形成以后，可以改变激素浓度（或者不用改变，使具体情况而定），可以使愈伤组织大量繁殖，为根芽的分化提供原料，有利于植物幼苗大量繁殖以及此生代谢物的生产。

三、仪器和药品：

1.仪器：

培养皿、剪刀、镊子、锥形瓶、滤纸、烧杯、电炉、石棉王、高压灭菌锅

2.药品：

大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机元素母液、生长素母液、蔗糖、琼脂

四、实验步骤：

1.培养基的配制：

取50ml大量元素母液，微量元素母液、铁盐母液、有机元素母液个5ml，放入1000ml烧杯中，称取蔗糖30克，琼脂7.5克加入850ml水（因为少被只能丁荣到900ml，所以不能超过这一体积）。

在电炉上煮沸，直至琼脂完全融化（注意：

不能出现年条状物质，煮至完全澄清）。

将煮好的培养基放在实验台上，加入细胞分裂素素母液500μl，生长素母液500μl，搅拌均匀，用氢氧化钠溶液将pH调整到5.8~6.0之间。

2.分装与灭菌

将配制好的培养基分装到150ml的锥形瓶中（每个瓶子大约50ml），用封口膜包好，放入高压灭菌锅，同时将实验操作所使用的培养皿（要垫上滤纸）、剪刀、镊子包好米病房如灭菌锅进行灭菌（121℃-126℃保持20分钟）。

3.接种

将灭菌好的培养基取出，让其冷却，凝固后放入超净工作台。

同时也将灭菌好的操作工具放入超净工作台。

打开紫外灯，杀菌20~30分钟。

杀菌完毕，关掉紫外灯，打开照明灯，点燃酒精灯，将接种材料放入，并用70%究竟擦手和外植体的培养瓶，确保所有的操作过程无菌。

无菌条件下将愈伤组织取出，放到培养皿中（已灭菌），用解剖刀将愈伤组织上的外植体切下来，切成合适的大小。

然后接种到培养瓶中（注意：

愈伤组织稍微插入培养基中），放入光照培养箱中培养（光照14小时）。

思考题：

1.为什么愈伤组织形成以后要进行增殖？

2.愈伤组织形成增殖为什么尽量切掉原来没有形成愈伤组织的外植题？

实验四、组织培养中芽的诱导

掌握.了解生长素对植物芽分化培养中的作用和激素使用的原则。

在植物愈伤组织分形成以后，改变激素浓度（提高细胞分裂素的浓度，使生长素浓度与细胞分裂素的的比例较低），可以控制植物芽器官的分化，促进芽的形成。

有利于植物幼苗的形成。

3.仪器：

4.药品：

将煮好的培养基放在实验台上，加入细胞分裂素素母液500μl，生长素母液200μl，搅拌均匀，用氢氧化钠溶液将pH调整到5.8~6.0之间。

杀菌完毕，关掉紫外灯，打开照明灯，点燃酒精灯，将接种材料放入，并用70%究竟擦手和愈伤组织的培养瓶，确保所有的操作过程无菌。

无菌条件下将愈伤组织取出，放到培养皿中（已灭菌），用解剖刀将愈伤组织尽可能的切成合适的大小。

然后入培养瓶中（注意：

1.为什么芽分化培养中，细胞分裂素的比例较高？

2.培养基配制中，经常有不凝固的现象，为什么？

该怎样预防？

实验五、组织培养中根的诱导

1.了解生长素对植物生根培养中的作用和激素使用的原则。

2.掌握培养基的配制方法。

3.掌握转瓶培养中的无菌操作技术。

在植物愈伤组织分化成芽以后，改变激素浓度（降低或者取消细胞分裂素的浓度，是生长素浓度较高），可以控制植物器官的分化，促进根的形成。

有利于植物幼苗的栽培培养。

5.仪器：

6.药品：

大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机元素母液、生长素母液、蔗糖、琼脂

将煮好的培养基放在实验台上，加入生长素母液200μl，搅拌均匀，用氢氧化钠溶液将pH调整到5.8~6.0之间。

将灭菌好的培养基取出，让其迅速冷却（最好用冰块冷却），凝固后放入超净工作台。

杀菌完毕，关掉紫外灯，打开照明灯，将接种材料放入，点燃酒精灯，并用70%究竟擦手，确保所有的操作过程无菌。

无菌条件下将无菌苗取出，放到培养皿中（已灭菌），用解剖刀将苗上的愈伤组织尽可能的切下来。

然后将无菌苗接入培养瓶中（注意：

形态学下部插入培养基中），放入光照培养箱中培养。

1.为什么生根培养中，最好切除芽上的愈伤组织？

实验六丙二醛（MDA）的测定

一、实验目的

1.掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。

2.了解丙二醛积累对细胞的伤害

植物组织或器官在衰老或逆境下遭受伤害，往往发生膜脂的过氧化作用。

膜脂过氧化的指标有很多，如丙二醛（MDA）的产生、过氧化物的碘量滴定、氧吸收、共轭双键测定等。

由于MDA的测定方法简便，所以常用来评价植物脂过氧化强弱的指标。

测定组织或器官脂质的过氧化反应所产生的丙二醛含量时，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性下加热与组织中的MDA产生显色反应，反应产物是粉红色的3,5,5-三甲基噁唑2,4-二酮。

用分光光度计测定532nm及600nm波长时的光密度值，根据光密度的大小可计算MDA含量。

三、实验材料：

实验室培养的愈伤组织

实验仪器：

分光光度计、匀浆器、离心机、离心管、水浴锅、试管

10%三氯乙酸（TCA）；

0.6%硫代巴比妥酸，先加少量的氢氧化钠（1mol/L）溶解，再用10％的三氯乙酸定容；

石英砂。

1MDA的提取称1g愈伤组织，加入5ml磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为MDA提取液。

2MDA的测定取1mlMDA提取液，加3ml27％三氯乙酸和1ml2%TBA。

混和液在95度水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却，然后离心10min，于波长532nm和600nm下测定OD值。

五、结果计算

以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1消光系数计算MDA含量。

分别计算衰老和对照组的值。

MDA浓度（μmol/L）=6.45（D532-D600）-0.56D450

D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。

六、注意事项：

1.0.1-0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；

2.MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。

时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；

3.如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。

4.低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5nmol·

L-1）

5.可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。

1.通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？

2.说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。

3.TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？

4.为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？

5.丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？

实验七过氧化物酶活性的测定

了解过氧化物酶的作用；

掌握常用的测定过氧化物酶的方法----愈创木酚法。

二、实验原理

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与光合作用、呼吸作用以及生长素的氧化等都有密切的关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

在过氧化物酶的催化下，过氧化氢将愈创木酚氧化成茶褐色产物，该产物在470nm处有最大光吸收，故可以通过吸光度的变化测定过氧化物酶的活性。

三、仪器与设备、试剂

材料：

愈伤组织

试剂：

0.05mol/L、PH5.5的磷酸缓冲液；

0.05愈创木酚溶液；

2%过氧化氢。

设备：

722型分光光度计、离心机、研钵（匀浆器）、容量瓶、量筒、吸管、试管

四、实验步骤

1.制备酶液

取1.0克愈伤组织放入匀浆器，加入5ml研磨承匀浆，再用3ml缓冲液洗涤匀浆器，将匀浆液转入离心管中，于4000rpm离心10min，上清液转入50ml容量瓶中，定容。

低温保存。

2.活性测定

取2.9ml磷酸缓冲液、1.0mlH2O2、1.0ml愈创木酚混匀，加入0.1ml酶液。

迅速放入34℃水浴中保温3分钟，然后迅速稀释一倍。

对照以水代替酶液，在470nm处比色，每隔一分钟记录一次吸光度，共记录5次，然后以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。

其中：

ΔA470为反应时间内吸光度的变化；

W为愈伤组织重量；

Vs为测定时所取的酶液提及；

t反应时间，VT为提取的酶液总体积。

实验八超氧化物岐化酶（SOD）的活性测定（选做）

了解超氧化物岐化酶（SOD）的作用，掌握氮蓝四唑法测定超氧化物岐化酶的方法。

超氧化物岐化酶普遍存在于动、植物体内，是意中清除超氧阴离子自由基的酶，它催化反应将氧分子所携带的一个电子和氢离子生成过氧化氢，过氧化氢可以进一步被分解。

本实验是根据超氧化物岐化酶一直氮蓝四唑在广夏的还原作用来确定酶活性的大小。

在有氧化性物质存在的条件下，核黄素可以被还原，在有氧条件下后者极易被再氧化生成氧自由基，可以将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大光吸收。

而SOD可以清除氧自由基，从而抑制了甲腙的形成。

所以反应的颜色越深，酶的活性就越低。

据此可以计算酶活性的大小。

三、材料、仪器与试剂

材料：

培养的愈伤组织。

高速离心机、分光光度计、试管

0.05mol/L磷酸缓冲液，130mol/L甲硫氨酸，750μmol/L氮蓝四唑，100μmol/LEDTA-Na2，20μmol/L核黄素（避光保存）

1.制备酶液

取1.0克愈伤组织放入预冷的匀浆器，加入5ml预冷缓冲液，研磨成匀浆，再用3ml缓冲液洗涤匀浆器，将匀浆液转入离心管中，于10000rpm离心20min，上清液即为酶液，低温保存。

2.显色：

取5ml试管4支，2只作为对照管，2只作为反应管，按照下表加入各溶液

试剂

用量ml

最终浓度

磷酸缓冲液

1.5

MET

0.3

13mmol/L

EDTA-Na2

75μmol/L

核黄素

10μmol/L

NBT

2μ

酶液

0.05

对照管用缓冲液代替

蒸馏水

0.25

总体积

3.0

混合均匀后将一支对照管放入黑暗处，其他各管照强光反应20分钟。

SOD的活性按照单位抑制NBT光还原的50%为一个酶活力单位，按照下式计算：

式中：

V是样品总体积；

A对照为对照管的吸光度，AE为样品管吸光度；

Vt为测定时样品用量。

W为样品鲜重。

实验九、十愈伤组织中多糖的提取（和黄酮二选一）

这次实验为物质提取，需要两次才能完成，多糖和黄酮二选一做

实验步骤：

1称取2g愈伤组织，磨碎，加5ml水研磨成浆。

2加入等体积氯仿，剧烈震荡，去氯仿层。

反复萃取两次。

3补加水至80ml，超声波处理10min，然后80℃水浴提取2小时。

4葡萄糖标准液的标准曲线的绘制

精确称取100℃烘至恒重的葡萄糖50mg，用水溶解并定容到500mL容量瓶中，分别准确吸取0mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL葡萄糖溶液于比色管中，以蒸馏水补充至3.0mL，再加入6％的新蒸苯酚溶液2．0mL，摇匀，迅速加入5．0mL浓硫酸，室温静置20min后摇匀．40℃恒温水浴15min，在486nm下测吸光度，空白用蒸馏水代替，作标准曲线。

5将提取后的溶液加热浓缩（或旋转蒸发浓缩），至10ml左右体积。

6加入等体积氯仿正丁醇（氯仿：

正丁醇=4：

1）溶液，剧烈震荡去蛋白，处理2-3次。

7取水相，加入5倍体积95%的乙醇沉淀至少8h。

（可见白色絮状沉淀）

85000r／min离心5min后弃上清，在沉淀中加入70%乙醇洗涤2次。

9将所得的沉淀70℃烘干，称量，记录质量。

10多糖含量的测定

取0．025g多糖粗制品，研磨后加少量去离子水溶解．转入25mL容量瓶中定容。

取1mL样品液稀释10倍，取稀释后的样品液2mL于试管中，依次加入0．06g／mL的苯酚1mL，浓硫酸5mL，静置10min摇匀，40℃恒温水浴15min后取出，测定0D486值，依据葡萄糖标准曲线计算含量。

实验十一、十二愈伤组织中黄酮的提取（和多糖二选一）

1称取5-10g愈伤组织，研磨成浆。

2至于烧杯中，加20mL的95%乙醇，超声波处理10min

3处理后的样品转入索氏提取器，补加95%乙醇，至固液比为1:

15，80摄氏度的条件下回流提取2小时

4提取液经抽滤后，去除固体残渣，滤液60摄氏度旋转蒸发仪中浓缩至浸膏状

5石油醚萃取至石油醚层无色

6水相再经正丁醇萃取，取正丁醇萃取物，保存备用。

7鉴定实验：

显色反应

（１）紫外光下呈色反应：

将提取溶液点在滤纸上，在紫外光下观察

（２）浓氨水反应：

将提取溶液点在滤纸上，干后再点1次，将滤纸在氨水上方熏2min，立即在紫外光下观察。

在空气中放置5min后，再在紫外光下观察。

（３）三氯化铝反应：

将提取溶液点在滤纸上，干后滴加1％三氯化铝乙醇溶液，吹干，在紫外光下观察。

8、含量测定

以芦丁为标准品制作标准曲线，移取适量黄酮提取液于l0ml的容量瓶中，加0.3ml的5％亚硝酸钠溶液，混匀放置6分钟，再加入0.3ml10％硝酸铝溶液，混匀放置6分钟，然后加入4ml的4％氢氧化钠溶液，用30％乙醇定容，摇匀，放置10分钟，在500nm处测定吸光度（以不加提取液的试剂为空白），根据回归方程（标准曲线）计算提取液中黄酮的含量。

实验十三、鸡胚的原代培养

（一）培养用品的清洗和消毒

1.了解细胞培养的常用器材。

2.掌握细胞培养用品的清洗和消毒方法。

细胞体外培养对培养环境的洁净程度和无菌要求很高。

培养环境中的微生物会污染培养基使细胞培养失败；

操作用具和培养瓶上残留的微生物降解物、无机离子和有机物会干扰培养细胞的贴壁，妨碍其生长。

因此细胞培养用品必须经过严格的清洗和消毒程序。

一般常用的消毒方法有干热灭菌、湿热灭菌、过滤灭菌。

三、实验器材

洗衣粉、肥皂、5%HCl、三蒸水（双蒸水）、每大组（4个同学）

250ml锥形瓶（3个）、150ml锥形瓶（3个）、培养皿（4个）、眼科剪（1把）、钝头镊子（一把）、弯头镊子（一把）、细菌过滤器（加滤膜）（2个）、烧杯（100ml以上）（2个）、玻璃棒（2根）、量筒（500ml）（1个）、三层纱布

（2）、离心管（1包）、枪头（1ml）（1包）、25ml培养瓶（4个）

1.玻璃器皿的清洗

先用洗衣粉洗，然后肥皂水煮30min，水洗干净，再在5%HCl中浸泡30min，水洗，最后用蒸馏水淋洗3~5次。

烘干、包装灭菌。

2.金属器皿的清洗

水洗，然后用75%酒精擦拭，包装灭菌。

实验十三鸡胚的细胞培养

（二）培养溶液的配制

1.了解细胞培养常用的培养液。

2.掌握过滤除菌方法。

细胞体外培养需要丰富的营养成分，常用的动物细胞培养基有199、DMEM、RAPI-1640等。

体外培养时需要维持适当的渗透压，常用的平衡盐溶液有PBS、Ringer、Hank’s等。

制备培养材料时，常采用机械解离、胰酶消化、螯合剂解离等方法。

三、实验步骤

1、199培养基的配制

称取0.49