组胚作业Word格式.docx
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2.Forkhead转录因子家族13
3.BHC8013
4.视黄酸和raldh2基因14
5.T-box家族14
6.叶酸15
7.microRNAs15
结语16
参考文献16
摘要
心脏起源于多细胞谱系，它的发育是一个复杂的过程，它是各种因子的生化相互作用的结果。
在研究心脏表达基因的启动子和增强子区域时可发现许多特殊性。
所有的这些过程涉及复杂的形态构建事件，但我们对它的分子机制知之甚少。
确定产生和形成心区的信号通路的本质将很有价值。
斑马鱼作为研究心脏发育的模式生物具有得天独厚的优势。
本文中主要介绍了与斑马鱼心脏发育有关的的调控因素，由于斑马鱼心脏发育调控较复杂，相关基因调控机制并未形成完整的体系，因此本文主要以心脏各组分的发育过程为线索，探讨心脏发育中的基因调控，并最后附述其他相关基因的功能。
由于心脏发育调控基因的复杂性和自己的能力有限，本综述不可能涵盖所有已知的影响心脏发育的基因，有关心脏发育的基因调控仍有待进一步的研究。
关键词：
斑马鱼;
心脏发育;
基因调控
Abstract
Cardiacoriginatedinthemulti-celllineage,anditsdevelopmentisacomplexprocess,whichistheresultofthebiochemicalinteractionsofvariousfactors.Whenstudyingpromoterandenhancerregionsofexpressedgeneaboutheart,wecanfindmanyparticularity.Alloftheseprocessesinvolvecomplexmorphologicalbuildevents,butlittleisknownaboutitsmolecularmechanism.Determinethenatureofthegenerationandformationofasignalpathoftheheartregionwillbeofgreatvalue.Zebrafishasmodelorganismstostudycardiacdevelopmenthasauniqueadvantage.Thispaperintroducestheregulationfactorsaboutzebrafishheartdevelopment.Morecomplexregulationofheartdevelopmentinzebrafishgeneregulationmechanismdidnotformacompletesystem,sothispapermainlyforcluestoeachcomponentoftheheartofthedevelopmentprocess,exploregeneregulationinheartdevelopment,andfinallytalkaboutthefunctionofothergenes.Duetothecomplexityoftheregulationofgeneinheartdevelopmentandmylimitedability,thisreviewcannotcoverallknowngenesaffectingheartdevelopmentandgeneregulationinheartdevelopmentremainstobefurtherstudied.
Keyword:
zebrafish;
cardiacdevelopment;
geneticdissection
一、斑马鱼
斑马鱼（zebrafish）（拉丁名：
Daniorerio），动物界，脊索动物门Chordata，辐鳍鱼纲Actinopterygii，鲤形目Cypriniformes，鲤科Cyprinidae。
体侧有像斑马一样蓝银相间的条纹，原产于印度东部、巴基斯坦及孟加拉国的小溪、稻田及恒河中游地区。
适宜水温25~26℃，Ph值为中性。
主要以红线虫、红虫等为食的肉食性动物。
斑马鱼作为模式生物有许多优点：
1.成鱼个体小，方便饲养。
斑马鱼成年个体长约4～6cm，雄鱼个体修长，雌鱼个体肥大，方便识别。
一升水中最多可以养5尾。
另外，斑马鱼个体较小，养殖花费少，能够大规模繁殖。
2.发育快、繁殖能力强、性成熟期短。
受精后约40分钟，就完成了第一次有丝分裂。
24小时后，主要器官已经形成，脑室、眼睛、耳和体节等清晰可见。
相当人类第28天的胚胎。
3个月可达到性成熟。
雌鱼每周产300枚卵，可保证每天获得成千上万的胚胎。
3.体外胚胎发育方便观察和操作。
胚胎在母体外发育并且透明，因此易于观察。
4.拥有较完善的胚胎和遗传学操作技术。
可以很方便地进行细胞标记和细胞谱系跟踪、胚胎的细胞移植技术；
还可培育单倍体及基因组倍增；
在基因功能研究方面，已发展了转基因技术、基因过量表达，体细胞克隆等技术。
5.品系资源丰富。
经过30多年的研究应用，目前已经有多个品系，并建立了斑马鱼基因数据库。
目前研究中常用的是斑马鱼野生型品系主要为Tuebingen品系。
此外，还有3000多个突变品系和转基因品系。
斑马鱼的心脏类似于人胚胎时的心脏，分为心房和心室，二者之间有瓣膜。
斑马鱼特别适合心脏发育的研究，这主要是因为：
1．斑马鱼的心血管系统发育过程与人类有许多共同点，与人类的心脏发育具有相似的基因调控途径。
2．斑马鱼胚胎体外受精，体外发育，完全透明，其心脏发育可以直接用眼睛观察，因此具有高度的可视性。
3．斑马鱼的胚胎可以不依赖于有功能的心血管系统，甚至在整个心血管循环缺失的情况下，它都仍然能通过对氧的被动运输而生存，继续正常发育一段时间，这就为心血管系统严重缺陷的细节观察提供了可能。
与鼠类模型相比，斑马鱼的主要优势是它提供了将经典遗传学与胚胎观察和操作结合起来研究的机会。
斑马鱼的这些优势，使得对斑马鱼的研究异军突起，成为近几年使用最多的进行心脏发育生物学研究的模式动物，极大地推动了心血管疾病发病机制的研究。
二、心脏发育的概述
心脏形态发生包括细胞决定、迁移和分化，且伴随一系列关键的形态发生事件。
斑马鱼的心脏由外层的心肌层和内层的心内膜2层构成。
心肌细胞和心内膜细胞都起源于体轴两侧靠近中后脑边界的中胚层细胞。
斑马鱼心脏早期发育历经了几个关键的过程：
首先，胚胎前端中轴两侧的侧板中胚层（ALPM）细胞被诱导分化形成心肌源细胞；
然后两侧的心肌源细胞向中轴不断迁移、会聚；
最终两侧前体细胞融合形成一个管状的器官心管（HeartTube）。
尽管其在纵向上显得是无差别的，但它按其在胚胎轴的位置，分成几个基因表达的特异性节段，为后来心房、心室、动脉囊、动脉干的雏形。
心管再向右进行环化，在此过程中出现广泛的分化和原始心脏组织的复杂改建。
最后房、室被隔开，肺动脉、主动脉也被分开，并逐渐形成瓣膜、小梁、传导系统和冠状循环，从而形成一个复杂的协调的器官。
图1斑马鱼心脏发育的过程
注：
L为左；
R为右；
A为前端；
P为后端；
蓝色细胞为心脏内膜细胞；
红色细胞为将来分化成心室的细胞；
黄色细胞为将来分化成心房的细胞。
三、心肌源细胞的调控—心脏发育的保守途径
心脏特异表达的转录因子是在早期的心脏区域被激活表达的。
其中，一个最早的在心肌源细胞中特异表达的转录因子是NKX2.5。
对于心肌源细胞的分化最早的研究来源于果蝇。
研究发现，果蝇中tinman基因的突变抑制了果蝇心脏的形成。
tinman基因编码的是homeobox转录因子，这个因子属于Nkx2基因家族。
Nkx2.5是该基因家族的另外一个成员。
在目前研究的脊椎动物中nkx2.5于侧板中胚层中正在分化的心肌细胞中表达，并且它的表达贯穿于心脏发育的整个过程。
在人和老鼠的心脏发育过程中，nkx2.5的突变都能导致心脏发育的严重缺陷。
由于nkx2.5基因表达有高度的特异性和保守性，以及它在心脏形成过程中的重要作用，tinman/nkx2.5已经成为研究心肌细胞分化的焦点，研究者也在尽力寻找nkx2.5上游的调控基因。
NKx2家族的转录因子被相似的信号调控如BMP2（在外胚层中表达）和FGF（两侧胚层中表达）。
且在被用BMP2和FGF处理的非心脏中胚层中心脏发生能够被诱导。
在斑马鱼中bmp2上的突变废除了NKx2.5和NKx2.7表达。
在脊椎动物中心脏的FGF信号作用的基因证据来自于斑马鱼的acerebellar（ace）突变（突变fgf8基因上）。
fgf8的表达发生在斑马鱼胚胎中的两侧中胚层。
在ace突变体胚胎中，NKx2.5和GATA4的表达减少。
且在ace突变体胚胎中引入fgf8能恢复NKx2.5和GATA4的表达。
在斑马鱼中，NKx2.5、GATA4、fgf8和bmp4在心脏先祖区域重叠的不同的区域中表达。
NKx家族转录因子在心肌源细胞中表达，其中NKx2.5是唯一的一个被研究在所有模式脊椎动物的心脏始祖细胞中表达的基因。
表达发生在注定发育成心脏的细胞中，而且其表达区域也超出心区向近尾部发展，在不参与心脏发育的细胞中也表达，即使是定型祖细胞被激光切除技术杀死也将如此。
脊索则可以提供抑制信号使位于近尾区的细胞不分化成心脏，从而确定心区后段边界。
也有人认为是通过抑制NKx2.5的表达而使位于近尾区的细胞不分化成心脏，从而确定心区后段边界。
且NKx2.5还能诱导心肌增生。
国外也有报道NKx2-5的表达可促进P19细胞和P19CL6细胞向心肌细胞分化，提高心特异基因的表达，且保护心肌免受胁迫引起的损害。
研究证实，NKx2-5基因调控心纳素、心脏a-actin，心锚蛋白重复序列蛋白、A1腺甙受体、钙网织蛋白、间隙连接蛋白40等基因的表达。
这些目的基因编码重要的结构蛋白转录调控心肌特性，说明NKx2.5有转录调控心肌程序的功能。
Geminin是细胞周期的重要调控因子,在细胞周期中能和Cdt1结合阻止DNA的再次复制，Geminin和cdt1的相互作用对细胞周期的调节非常重要。
geminin影响了心肌源细胞的诱导和分化,它抑制了非心脏区域nkx2.5的诱导。
另一方面,geminin还影响了胚胎发育的左右平衡，geminin通过改变bmp4的表达模式,影响了bmp4下游的一些途径和因子从而改变了心脏loop的方向,这一途径是与胚胎发育的左右平衡模式相关的。
在心脏的特化过程中，心肌原始细胞产生于前端的侧板中胚层（ALPM），位于前端侧板中胚层下方的前端内胚层对于调节心肌细胞的诱导就有着重要的调节作用。
目前的试验也证实了前端内胚层对于诱导和维持心脏分化进程的重要作用。
内胚层能够分泌FGFs、Activin和BMP等多种信号分子。
其中，BMP2能够在非心脏的区域诱导心肌细胞marker基因的表达。
Noggin和BMPs分子高度亲和，从而阻止了体外培养的侧板中内胚层心肌细胞的分化。
心脏分化起初不稳定，需要一个持续不变动的环境刺激来保证心脏分化的稳定发生。
在斑马鱼和非洲爪蟾中这种稳定性就是依赖于BMP信号途径，因此，BMP2的存在限定了心脏区域起始分化的界限。
GATA家族是一类具有锌指结构的转录因子，在心脏的形成中也具有重要的作用。
在脊椎动物的心脏中表达3种GATA基因：
gata4～6。
在斑马鱼中，GATA5的功能与老鼠中GATA4的功能类似。
斑马鱼gata5由faust位点编码，对faust突变体的研究表明，在早期的胚胎发育过程中，GATA5对于产生正常数量的心肌前体细胞以及维持一些心肌特异表达的基因，包括nkx2.5的表达水平有重要作用。
同时心脏原始细胞向胚胎中轴迁移的过程也需要GATA5的参与，因此gata5的突变体会导致两侧的心脏原始细胞最终不能融合而形成心脏二分（CardiaBifida）的表型。
GATA5的过量表达还导致nkx2.5的异位表达以及形成异位的具有心肌细胞跳动功能的细胞团。
目前在斑马鱼和非洲爪蟾中越来越多的试验证明，用反义morpholino寡聚核苷链工具使gata6基因的功能缺失后，心脏细胞的分化受到了影响。
GATA6的这种作用更多地体现在心脏原始细胞的成熟过程中，而不是起始诱导的过程。
在斑马鱼中已经证明了GATA基因在对nkx2.5的调控和心肌细胞分化中的贡献。
据报道，GATA基因和NKX2.5在蛋白质水平有直接的相互作用，从而调控了ANF、CARP（cardiacrestrictedankyrinrepeatprotein）启动子等基因的表达。
GATA4和NKX2.5共同结合到ANF基因的启动子上，发挥着协同的激活效应：
GATA4的碳末端结合NKX2.5碳末端有自主抑制功能的结构域后，导致蛋白质构象的改变，进而暴露出NKX2.5的激活结构域。
在这个过程中，GATA5能够替代GATA4和NKX2.5相互作用。
因此NKX2.5能募集GATA4或者GATA5形成转录的激活复合体，激活下游某些心脏特异基因的表达。
肌肉细胞特异性增强因子2基因（Myocytespecifific-enhancerfactor2，mef2）广泛存在于果蝇、斑马鱼、小鼠和人类中。
mef2基因主要在心肌细胞分化过程中起作用并参与心脏的收缩功能、心肌肌节的组装，mef2a功能下调导致心肌肌节的组装紊乱，mef2a的功能完整是心脏正常收缩所必需的。
有假设认为mef2通过与别的谱系限制性转录因子之间进行蛋白质与蛋白质的直接相互作用形成一种联合作用机制，从而激活每一个肌源型的分化程序。
如在骨骼肌细胞谱系中，mef2因子就是通过与含bHLH的MoyD转录因子家族成员的作用激活骨骼肌特异转录。
研究证实BMP-2和MEF2A在胚胎心脏中共同表达，BMP-2可以调控新生心肌细胞MEF-2A的表达，有人提出了提出BMP2-MEF2A通路调节心脏收缩的模型。
适用于mef2激活细胞特异性基因的一般模式也在心脏谱系中发挥其功能，且几个候选分子也许可作为mef2的协同因子，如NKx2.5和GATA转录因子家族成员，及两个bHLH因子—dHAND和eHAND。
但目前还没有直接的证据。
在脊椎动物中有4种含MADS框的mef2基因（mef2a,mef2b,mef2c,mef2d）。
它们在发育中的肌肉细胞谱系及别的细胞类型中广泛的表达。
它们的蛋白产物（含有MADS区域和高度保守的MEF2区域）只在肌肉细胞、心脏和脑组织中有高丰度。
这表明在MEF的调控中存在有后转录调控机制。
大量的研究显示，mef2的表达和功能是在多个细胞水平上被调控的，通过多重调控机制作用，一个细胞能保证对mef2活性的严格调控。
四、WNT11信号途径对心脏原始细胞会聚过程的调控
在脊椎动物胚胎发育的过程中，许多器官的前体细胞诱导分化都是位于体轴的两侧，随后朝着胚胎中轴会聚，最后组装成一个最原始的器官。
心脏的发育过程也遵循这样的过程，首先在斑马鱼6个体节发育时期，心肌源细胞从前端的侧板中胚层分化出来并且位于体轴的两侧。
随后这两侧的细胞再向中间迁移，最终会聚形成原始的管状心脏。
如果这一过程受阻，两侧的细胞不能正常会聚，则会出现心脏二分的表型。
2000年Heisenberg的研究小组指出，在斑马鱼中，wntll非经典信号途径调节了原肠运动中的向中会聚和延伸的过程（ConvergenceandExtensionMovement）。
而后又有研究确定了非经典的Wnt信号途径中参与这一过程的一些分子。
后来的研究又迸一步证明了斑马鱼胚胎的会聚延伸运动需要Wnt非经典途径中的一些胞内分子，包括RhoA、Rac1、Cdc42和JNK等。
同时Wnt4a和Wntllr又被确定为调节会聚延伸过程的2个新型分子。
而且同时下调Wnt4a和Wnt11r或者下调Wnt4a或Wnt11r与Slb/wnt11的组合，相比下调单个分子而言，会聚延伸过程将出现更严重的缺陷。
非经典Wnt信号通路下游有很多的分枝，涉及这一过程调控的有Dvl/RhoA分枝，另外还有RhoKinase2分枝。
在非洲爪蟾和老鼠的研究中还发现，Writ11信号途径还参与了心脏细胞的分化，以及心脏可收缩表型的诱导。
而在鸡胚的研究中却发现神经管分泌的Wnt信号能抑制前端邻近的轴旁中胚层心脏的形成。
但是在斑马鱼中，目前还没有关于Wnt信号是否对于心脏分化有影响的研究报道。
这也说明关于Wnt信号通路在斑马鱼心脏发育过程中的作用还有待进一步的研究。
五、环化
当斑马鱼心肌源细胞向中融合之后，就会沿前后轴延伸形成心管。
在胚胎24h的时候，心管呈现出向胚胎左侧倾斜的趋势。
随后，心管的位置又逐渐返回到体轴中线。
48h之后，心室向右偏转，心房则向左偏转，这样心房心室之间形成了一定的弯曲角度，且位于身体的左侧，这个过程就是心脏的环化过程。
如果在24h时期，心管是向胚胎的右侧倾斜，则到48h，心脏环化的方向将相反，心脏位于斑马鱼的右侧。
从整个过程来看，斑马鱼心脏的左右不对称性在心脏环化过程之前就已经形成了。
心管向右的环化在所有的脊椎动物中均有发生。
环化不仅使心管的形态由前后转变为左右结构，而且对于心脏腔室的正确定位和心脏与血管系统的合并是很重要的。
虽然dHAND和eHAND分别在左右心室互补性表达，但考虑到他们在侧部中胚层的对称表达，所以认为其不大可能与环化方向的建立有关。
而转化因子TGF-β家族成员的左右不对称表达控制心脏环化的方向。
Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制还并不十分清楚。
而且NKx2.5对于发育中心脏的正确环化也是必需的。
胚胎发育20体节的时期（心管融合时期），BMP4在心脏区域就有非常特异的表达，且正好呈现了不对称性（其他一些基因如nkx2.5、mef2都是对称表达的）。
这个时期，BMP4为一环形表达区域，位于头部中后脑边界上方，并且左侧侧板中胚层的表达强于右侧侧板中胚层的表达。
研究发现，如果心脏BMP4不对称表达模式的改变，将影响心脏的环化过程。
shh在很多系统中都证明位于BMP4途径的上游。
在斑马鱼中注射了shhmRNA之后，BMP4的表达增强，同时心脏的环化过程就受到了影响。
据报道，以斑马鱼为模型，采用能够热激活的斑马鱼系，研究BMP4信号在左右对称中的影响发现，BMP信号主要影响了发育的2个时期。
一是斑马鱼体节形成阶段，在右侧的侧板中胚层区域BMP4抑制了spw的表达，从而调节了内脏和心脏的左右不对称性。
在Kupffer’svesicle中BMP4通过调节leftyl的表达抑制了spw的表达。
二是在体节形成阶段晚期，BMP信号途径不再调节内脏发育的不对称性，但是仍然凋节心脏左右发育的不对称性。
试验结果表明，BMP4对右侧侧板中胚层中spw表达的抑制，位于Nodal信号途径的上游。
而在更晚的阶段，后侧的侧板中胚层中则位于Nodal信号途径的下游，调节着心脏的环化过程。
六、心室
所有的脊椎动物中，早期功能性胚胎心脏由两腔室构成：
心房—它保留薄壁并以低压接收静脉回流；
心室—通过在发育中增生和肥大加厚。
Hox基因决定胚胎前后体轴方向结构特异性，它控制细胞分化和个体各部分的复杂形态建成，而视黄酸通过一类依赖于配体的DNA结合受体的家族与基因的结合来直接影响Hox基因的表达。
心房和心室的先祖在早期阶段存在重要的不同。
螺旋-环-螺旋基因在心脏腔室的形成中扮演一个重要的角色。
dHAND和eHAND在空间上独特的表达模式，使它们成为控制心管节段性发育的候选基因。
HAND基因的突变分析表明，其在心脏发生过程中与胚外中胚层、心管和心室的发育有关。
但HAND基因的表达是腔室特异性而不是胚胎体侧特异性的，所以它们与心脏特定的腔室分化无关。
dHAND对将要形成右心室的一段线性心管的一群心肌源细胞群体的扩展与分化是必需的，从而认为dHAND能调控右心室的发育。
且一个handoff等位基因的突变阻断了两侧心脏前体的融合，并导致了心脏的分叉现象，这表明，dHAND可能在心脏形态建成中也起作用。
eHAND为左心室标志基因，但它在心脏形态发生中的准确角色尚不清楚。
在直线心管时期和环化时期，eHAND在整个静脉窦，心房区及将来发育成左心室的区域均表达。
目前并不清楚是什么控制心室壁生长模式从沿着心脏纵轴的生长向使壁变厚的同心生长转变。
在斑马鱼中，3个基因中的突变（santa,valentine,heartofglass）在一个单层时期阻止心室壁的生长。
这些胚胎发育成极其扩大的心脏腔室。
在心室心肌变厚不久之后，心室的内壁开始形成皱褶。
有证据表明这种被称为小梁形成的不规则加厚的发生涉及从心内皮到心肌的信号。
神经调节蛋白来自心内膜的释放，且它的受体—erbB2和erbB4均存在于心肌。
erbB2或神经调节蛋白的定点突变均具有相似的表型，即小梁形成极大的缺损，且心室壁是薄的。
心内膜与心肌间的信号转导对于心室的发育也是非常重要的。
七、房室的分隔
心室和心房的隔通过邻近心肌壁的生长产生。
这样，干扰心肌壁生长的基因突变，如vcam1和RxR2，引起间隔缺失。
BMP1相关基因——tolloidlike1，似乎在心室分隔中起一个首要的角色。
似乎隔膜的生长对肌肉分化中的紊乱特别敏感。
在左心室eHAND在将来形成心室间瓣的区域的表达受抑制，当间隔形成时则没有表达。
八、心内膜
心内膜细胞在胚胎生长中为血管形成提供了支架。
并为发育的血管提供血管调节和溶栓剂活性的重要来源。
在心脏中，心内膜层提供了小梁形成信号和瓣膜的组分。
心肌与心内膜的作用导致横隔的形成，心内膜与心肌层的作用导致垫层的形成。
最初的内皮管，包括心内膜，是通过血管发生过程（散布的中胚层成血管细胞的融合）形成的。
至少这些成血管细胞中的一些被认为是与最初的内胚层血细胞起源于一个谱系，它们均起源于一个称为成血管细胞的共同前体。
成血管细胞建成的最可能的上游候选基因是clocbe，在斑马鱼中它的突变体阻止内皮和造血细胞谱系的形成。
clocbe以一种心内膜细胞自主的方式起作用，且来自野生型胚胎的细胞能在clocbe突变体中产生心内膜。
有趣的是心肌腔室甚至能在心内膜缺失时形成，于是将心房从心室程序中区分出来的模式信息定位于心肌层，心内膜和血管建成所需要的其他基因是vecf和它的受体。
瓣膜在腔室之间的边界形成，这一过程依赖于心内膜和心肌之间的位点特异性相互作用。
位于房-室管道和流出道上的心内膜细胞从心内膜表面迁出，以形成称为心内膜垫的前瓣结构的间充质组分。
在斑马鱼中jekylll突变将干扰心内膜垫的形成。
TGF-β突变型胚胎有瓣膜和流出道瓣膜缺陷。
α1，α2VI胶原蛋白基因在房室心内膜垫发育成瓣膜小叶和膜间隙的形态发生中起重要作用。
RasTG1和RasTG2是PAQR（ProgesteroneandAdipoQreceptor）家族成员。
PAQR家族为脂肪细胞分泌并参与调控糖脂代谢的脂联素受体，近年
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