商洛不同栽培小麦品种抗旱性比较Word文档格式.docx
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1.技术要求
在实验过程中要熟练掌握理论知识和实验能力，要有分析和解决实际问题的能力，掌握和了解形态学指标对小麦抗旱性的作用和意义，并能完成其形态学指标的测量和分析。
查阅文献、书籍，了解掌握生理学指标与抗旱性的关系，例如：
POD（过氧化物酶）、SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）、游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA（丙二醛）、相对电导率在植物体内的作用机理，以及含量表示的意义。
还要了解各各指标的多种测量方法，至少掌握其中一种测量方法。
查阅文献了解垂直板凝胶电泳的原理，掌握其方法，了解其酶带的意义，以及对实验结果的分析能力。
熟练掌握实验仪器设备的应用，如电泳仪、紫外线分光光度计、DYY-10C型电导仪、电冰箱、制冰机、凝胶电泳系统、光照培养箱、高速离心机、电子天平、研钵、量筒、微量移液枪、移液管、PH试纸、电炉等。
并能完成实验的数据测量、记录和分析。
仔细认真的完成实验数据的测量以确保数据的准确性，并对数据做出合理的分析，并的出结论。
2．工作计划及时间安排：
<
1>
查阅文献确定题目：
2010年7月01日-2010年07月15日
2>
拟写开题报告：
2010年07月16日-2010年07月31日
3>
预实验：
2010年08月1日-2010年08月26日
4>
正式实验：
2010年10月27日-2010年11月22日
5>
撰写论文：
2010年11月23日-2011年6月14日
6>
论文答辩：
2011年6月15日
7>
根据答辩委员会要求修改论文定稿
8>
论文打印及装订
9>
毕业论文工作总结、资料归档
指导教师要求：
（签字）年月日
教研室主任意见：
系室意见：
目录
商洛不同小麦品种抗旱性比较5
1选题背景5
1.1研究目的和意义5
1.1.1研究目的：
5
1.1.2研究意义：
6
1.2文献综述6
1.2.1小麦抗旱性形态指标的研究现状6
1.2.2小麦抗旱性生理生化指标的研究现状6
1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳的相关研究6
2实验材料处理、方法及结果分析7
2.1实验材料7
2.1.1实验材料7
2.1.2实验材料处理7
2.2试验仪器与试剂7
2.2.1实验仪器7
2.2.2实验试剂7
2.3技术路线8
2.4实验方法及结果分析8
2.4.1形态学指标研究8
2.4.1.1胚芽鞘长度分析8
2.4.1.2幼苗期根长度分析8
2.4.1.3幼苗期根数目分析9
2.4.1.4小麦发芽率分析10
2.4.2生理生化指标研究10
2.4.2.1POD酶的含量测定及分析10
2.4.2.2SOD酶的含量测定及分析11
2.4.2.3CAT酶的含量测定及分析12
2.4.2.4脯氨酸的含量测定及分析13
2.4.2.5可溶性糖的含量测定及分析14
2.4.2.6可溶性蛋白的含量测定及分析14
2.4.2.7MDA酶的含量测定及分析15
2.4.2.8电导率的测定及分析16
2.4.3抗旱性不同小麦品种聚丙烯酰胺凝胶电泳研究17
2.4.3.1POD同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分析17
2.4.3.2EST同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分析19
3结论与讨论20
4参考文献20
摘要：
为了选择抗旱性较好的品种，用20%的聚乙二醇6000（PEG6000）模拟干旱胁迫对商洛栽培小麦绵阳19、832-9、商麦8928、植8788、商麦5226-1、商麦5226-8、小偃15、小偃22、新洛8号、新洛11号、商麦9722分析，从形态学指标（小麦胚芽鞘长度、根长度、根数目）等方面综合分析，从生理生化指标：
过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛（MDA），结合聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳技术分析，研究不同品种小麦抗旱性差异，结果表明：
绵阳19、832-9、商麦5226-1、商麦5226-8、植8788、商麦8928、小偃15、新洛8号为抗旱性较好的品种，为小麦的育种和丰富小麦资源提供了依据。
关键词：
小麦；
抗旱性；
同工酶；
电泳;
Abstract:
Inordertoselectvarietieswithgooddrought,with20%polyethyleneglycol6000（PEG6000）simulateddroughtstressonShangluoMajorWheatMianyang19,832-9,commercialwheat8928,plant8788,commercialwheat5226-1,commercialMak5226-8,Xiaoyan15,Xiaoyan22,thenewLuo8,11,NewLuo,ShangMai9722analysis,theappearanceofmorphologicalindicators,wheatcoleoptilelength,rootlength,rootnumberandsooncomprehensiveanalysisofselectedvarietieswithgooddroughtresistance,physiologicalandbiochemicalindicatorsfromthePOD,SOD,CAT,MDA,solublesugar,solubleprotein,proline,electricalconductivity,combinedwithverticalslabpolyacrylamidegelelectrophoresisanalysis,lookingfordroughtandnon-droughtthedifferencebetweenthespecies,theresultsshowthat:
Mianyang19,832-9,commercialwheat5226-1,5226-8commercialwheat,planted8788,commercialwheat8928,Xiaoyan15,anewLos8isbetterdroughtresistancevarietiesrichinwheatbreedingandwheatresourcesprovided.
Keywords：
Wheat;
droughtresistance;
Isozyme;
electrophoresis;
protectiveenzyme;
POD
1选题背景
1.1研究目的和意义
通过20%PEG（聚乙二醇）6000模拟干旱胁迫，初步的分析商洛11种小麦绵阳19、832-9、商麦8928、植8788、商麦5226-1、商麦5226-8、小偃15、小偃22、新洛8号、新洛11号、商麦9722抗旱性差异。
干旱是影响植物生长和产量最重要的限制因素。
商洛是以山坡地为主的地区，干旱成为了影响商洛小麦生长和产量的主要原因，因此分析商洛小麦抗旱性差异是选择适应商洛生长的小麦的重要参考资料之一。
1.2文献综述
1.2.1小麦抗旱性形态指标的研究现状
据各研究者对不同物种进行干旱胁迫试验表明抗旱能力强的叶片比较浓绿，挺拔，且根数较多根长比较长，胚芽鞘较长。
赵会君[1-2]等人采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术对胚芽鞘长度的研究表明抗旱性强的品种胚芽鞘长度均大于干旱敏感的品种。
得出结论是小麦抗旱育种应选择胚芽鞘较长的品种。
1.2.2小麦抗旱性生理生化指标的研究现状
SOD能将O2-转化成毒性较小的H2O2和O2。
（2O2-+2H+
O2+H2O2）。
POD和CAT又可以进一步清除H2O2生产无害的氧气和H2O（2H2O2
2H2O+O2），从而协调完成体内的保护作用。
目前我国抗旱性的生理生化指标研究主要集中在POD（过氧化物酶）、SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）、游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA（丙二醛）、相对电导率等方面[3-52]。
张峰[3]等人年研究水分胁迫和复水过程中小麦抗氧化能力的变化，发现水分胁迫导致SOD、CAT活性增强。
马文丽[4]等人研究了镉胁迫对黑小麦SOD同工酶的影响，经过镉胁迫后，根与幼苗的SOD同工酶表达均受抑制，且根比幼苗表现更为明显。
尹钧[5]等人研究对不同发育特性的小麦品种进行春化、脱春化处理，经凝胶电泳分析超氧化物歧化酶（SOD）与春化发育基本无相关性。
王琳等[6-8]还通过研究蛋白质判断植物生长状况。
孟学平等[9-16]影响过氧化酶同工酶的因素做了相关研究。
1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳的相关研究
近十年，不断有科学家采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法通过对不同植物过氧化物酶同工酶的研究来判断亲缘关系或判断同一植物不同品系的进化程度。
时丽冉[17]等利用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，对干旱和盐胁迫下的小麦叶片中过氧化物同工酶活性降低，且盐胁迫后叶片中少了一条酶带。
根部过氧化物同工酶酶谱差异较大，在干旱和盐胁迫下，根部过氧化物同工酶活性升高，但没有酶带的变化；
张慧茹[18]等采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对本区8个新品种小麦不同时期的根进行过氧化物酶同工酶分析。
结果表明：
同一时期不同品种、同一器官的过氧化物酶酶谱均有差异。
孟学平等[19]利用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术对18个冬小麦品种4个发育期的POD同工酶进行了研究，表明冬小麦18个品种间POD同工酶谱无明显差异。
刘海学等[20-35]分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对不同物种亲缘关系做了鉴定。
颜泽洪[36-47]等在遗传育种、品种选育、物种保护方面做了研究。
综上所述，同工酶的研究对抗旱、亲缘关系鉴定等方面的研究都起着重要的作用。
同时．通过对十年来有关同工酶研究的总结，我们可以看到对同工酶的研究已经越来越深入．对抗旱及亲缘关系鉴定研究等方面的阐释越来越清晰．同时也不难发现，我国对小麦抗旱研究已经比较深入，我们应该进一步深入研究适宜不同地区生长的小麦，因地种麦，以便最大限度的为人类服务。
2实验材料处理、方法
2.1实验材料
2.1.1实验材料
实验材料商洛栽培的十一种小麦，由商洛学院于世浩提供，有绵阳19、832-9、商麦8928、植8788、商麦5226-1、商麦5226-8、小偃15、小偃22、新洛8号、新洛11号、商麦9722。
2.1.2实验材料处理
选择饱满程度一致的六种小麦种子个500粒，用70%的酒精消毒几秒后，用自来水反复冲洗，再泡种24h，对小麦分别编号为1-11。
然后以250粒/（1/3）皿放入专门的培养器里，水培进行对照实验，定期换水。
培养小麦到两叶一心时在处理组加入20ml20%的PEG6000，而对照组加入等量的水进行培养。
观测记录、照相，48h后分别剪下用密封袋密封放入4冰箱保存备用。
2.2试验仪器与试剂
2.2.1实验仪器
电泳仪、电泳槽、电冰箱、制冰机、UV755B型紫外分光光度计、光照培养箱、人工智能培养箱、高速离心机、研钵、烧杯、量筒、电子天平、试管、具塞刻度试管、移液管、吸耳球、培养皿、微量移液枪、带针头的注射器、人造沸石、石英砂、滤纸、PH试纸、剪刀、镊子、玻璃棒。
2.2.2实验试剂
PEG（聚乙二醇）6000、无水乙醇、Tris、甘油、甲苯、冰醋酸、浓盐酸、蔗糖、甘氨酸、蒸馏水、坚牢RR盐、琼脂粉、NaClO、磷酸钾、磺基水杨酸、茚三酮、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、KCl、PVP、Triton-100、EDTA、柠檬酸、溴酚蓝、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、α-醋酸萘酯、β-醋酸萘酯、丙酮、TEMED、过硫酸铵、核黄素、Ca（NO3）2、KNO3、NH4H2PO4、MgSO4、考马斯亮蓝R250、NaOH、TBA、TCA三氯乙酸、H2O2、硫酸、草酸H2C2O4、脯氨酸、KMnO4、氮蓝四唑NBT。
2.3技术路线
2.4实验结果分析
2.4.1形态学指标研究
2.4.1.1胚芽鞘长度分析
植物抗旱性的强弱与小麦的胚芽鞘有正相关的关系[2]，从图中可以看出商麦8928、绵阳19、新洛8号、小偃15的胚芽鞘长度较长，而小偃22较低的原因有一个是实验室放置的位置在水中央，被水淹没较多，可能影响了其正常生长和胚芽鞘长度。
2.4.1.2幼苗期根长度分析
根系是小麦的主要吸收器官，根系的发达程度也是小麦的抗旱性指标之一。
因此根长与小麦的抗旱性有一定的关系，不同的品种根长有着明显的差异，根长较长的有新洛8号的根长为53.10mm、小偃15的根长为51.26mm、新洛11的根长为46.60mm、而根长较短的有小偃24.32mm、商麦8928为24.98mm。
从图中可以看出新洛8号、小偃15、新洛11号、商麦9722、绵阳19的小麦根长度较长，可初选为抗旱性较好的品种。
而小偃22、商麦8928的根长度较短。
2.4.1.3幼苗期根数目分析
因此跟数目与小麦的抗旱性有一定的关系，不同小麦品种跟数目也有所差异，但从图中可以看出跟数目差别不是很大，较多的有商麦5226-1，小偃15，新洛8号绵阳19。
而较少的有小偃22，832-9，这可能与小麦的放置位置有关，这两个都放在水中央的纱网上，可能是由于水分较多而影响正常生长发育，中间哪行统一偏低，生长不好，还有一个放在中央的是商麦5226-1，有此推断，5226-1的跟数目应该数据显示的还要高些。
从图中可以看出根个数较多的有商麦5226-8、小偃15、新洛8号绵阳19，新洛11，商麦5226-1，植8788，商麦8928，商麦9722，而根个数较小的有小偃22、832-9。
2.4.1.4小麦发芽率分析
从图中可以看出绵羊19、植8788、商麦5226-1、小偃15、小偃22、新洛8号，的发芽率较高，而商麦8928、的发芽率较低
2.4.2生理生化指标研究
2.4.2.1POD酶的含量测定及分析
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织中。
过氧化物酶在有过氧化氢的条件下，能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的物质，可用分光光度计测量生成物的含量。
参考张志良实验方法
取幼苗1g，加20mmol\LKH2PO45ml，冰浴研磨，再以4000r\min离心15min，取上清液于冰箱中冷保存。
下层沉淀用5mlKH2PO4溶液提取一次，合并两次的上清液。
取两只比色杯，一只中加入反应混合液3ml，KH2PO41ml，另一只中加入反应混合液3ml，酶液1ml。
于分光光度计470nm波长下测量OD值。
比较胁迫前后POD酶活性的增长变化情况如下表：
从图中可以看出植8788在20%的PEG6000胁迫下POD酶活性迅速增加，比较明显而商麦9828，商麦5226-1，绵阳19，而832-9，新洛8号，新洛11号，小偃15商麦5226-8是负增长，有待进一步研究。
2.4.2.2SOD酶的含量测定及分析
超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化物酶之一，SOD的反应产物H2O2能在过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的作用下生成基态的氧和水，保护植物免受氧化，其活性的强弱关系到植物的抗逆的能力，因此，测量干旱胁迫下植物体内SOD酶活性有助于研究植物的抗旱性。
SOD活性采用氮蓝四唑（NBT）还原法，SOD是植物体内清楚活性氧的重要酶类之一，如果积累超过保护酶系统的清除能力，并对抗氧化酶系统造成伤害，导致SOD活性下降，图中大多品种的SOD没活性有所下降，而新洛8号的活性上升，表明其受伤害程度还在植物可控范围之内，即抗旱性较好。
在20%PEG6000模拟干旱胁迫下SOD酶活性差异，分别取胁迫和对照幼苗0.5g，加入酶液，冰浴研磨过滤，以10500xg离心20min。
在54ml14.5mmol\Ldl-甲硫氨酸中加入EDTA、NBT、核黄素溶液各2ml，混匀。
在有3ml混合液中加入粗酶液，于分光光度计560nm下测量，并计算。
从图中可以看出在20%PEG6000胁迫情况下不同品种小麦SOD酶活性存在差异，主要集中在10-60ud，这个孟德敬【49】的研究结果相近。
其中绵羊19、832-9，植8788，5226-1在胁迫情况下SOD酶的活性降低较多，而小偃15新洛11号，小偃22变化较小，而新洛8号商麦9722有所增加。
2.4.2.3CAT酶的含量测定及分析
从图中可以看出CAT含量在20%PEG6000的胁迫下变化很大，而且有升高又降低，据文献报道，CAT含量是随着胁迫程度的加剧，含量先升高在降低，有些文献论述CAT活性是下降的[52]，增加较大的是小偃15、832-9小偃22，新洛8号，而有下降趋势的有商麦5226-1，新洛11号，绵阳19有所下降，说明其在进一步清理体内H2O2起到了重要作用。
2.4.2.4脯氨酸的含量测定及分析
脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质，它既可以作为可溶性物质改变细胞的渗透势以防止脱水，还具有许多其他与抗旱性有关的特性：
如其具有高度的吸湿性，可抵制氧化和水解产生的有毒物质；
它可以在干旱的情况下贮藏氮，为植物再度得到水分供应后的生长提供了营养物质；
它还可与蛋白质分子上的疏水基作用，扩大亲水基的表面，从而增强蛋白质的稳定性，起了在干旱条件下保护膜结构的作用。
当植物遭受渗透胁迫，植物体内脯氨酸大量累积，因此植物体内脯氨酸可反映植物体内的水分状况，作为植物缺水的参考标准。
游离脯氨酸含量游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸法。
取叶苗0.5g，用3%磺基水杨酸5ml研磨，沸水浴10min，冷却后，3000r\min离心10min，取上清液。
加蒸馏水2ml，2ml冰醋酸和4ml25%酸性茚三酮，与标准曲线进行比色，最后查得脯氨酸含量。
从图中可以看出在20%PEG6000胁迫下脯氨酸含量较小的有商麦5226-1、商麦5226-8、小偃15、绵阳19、新洛8号，即在干旱胁迫下植物受到的伤害较小，是抗旱的表现，而商麦8928,、新洛11号、小偃22、商麦9722的脯氨酸的吸光度明显升高，也就是说在干旱胁迫下其体内水分含量迅速下降，细胞受伤害程度较大，是不抗旱的一种表现。
图中商麦5226-8的吸光度有所下降有待于讨论。
2.4.2.5可溶性糖的含量测定及分析
可溶性糖由于分子量低，高度水溶性，在生理pH范围内无静电荷及低毒性等特性成为植物组织内一种理想的渗透调节物质，可溶性糖还具有生成迅速、对代谢活动和酶活性影响小，在干旱胁迫下，可溶性糖的含量会发生改变[50-51]。
糖在硫酸作用下生成糠醛，再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。
因此可溶性的测定用蒽酮-硫酸比色法。
标准曲线绘制[51]。
分别去胁迫和对照叶片各0.5g磨碎，于离心管加入4ml80%酒精，于80℃水浴中搅拌40分钟，离心取上清液，残渣加入2ml80%酒精提取2次，合并上清液。
取上述酒精提取液1ml，加入5ml蒽酮试剂，沸水浴10min，冷却。
于625nm处测OD值。
从标准曲线上得到提取液中糖的含量。
在20%PEG6000的胁迫下可溶性蛋白的含量变化不大，其中增加较多的有新洛8号，小偃15、新洛11，商麦832-9、而变化不大的有商麦8928，绵阳19、小偃22、负增长最大的是植8788，有待于进一步研究分析。
2.4.2.6可溶性蛋白的含量测定及分析
用Folin-酚试剂法，植物中含有能与Folin-酚试剂产生颜反应的物质，常使测定值比实际值高。
利用染料能使蛋白质染色的特性，发展成一种简单快速的测定蛋白质的方法，
于不同浓度的标准牛血清蛋白溶液2ml，分别加入染料试剂2ml，混匀，于620nm处测定光密度，以蒸馏水加染料试剂作为空白对照。
绘制标准曲线。
用上述方法测定样品的620nm处光密度，然后从标准曲线上查得可溶性蛋白含量。
在20%的PEG6000胁迫情况下，可溶性蛋白含量增长较多的有小偃15，新洛8号，新洛11，商麦8928。
而变化较小的有832-9，植8788，绵阳19，商麦5226-8，小偃22，为相对抗旱品种。
2.4.2.7MDA酶的含量测定及分析
植物器官在干旱胁迫下，往往发生膜脂过氧化，引起活性氧的积累，丙二醛是植物脂质氧化的主要产物之一，它能使膜中酶蛋白发生交联并失活，损伤细胞膜的结构和功能，因此MDA是检测植物膜在逆境条件下受伤害的一个重要的指标，其积累是活性氧毒害作用的表现，通常利用它作为膜质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对干旱逆境条件反应的强弱。
丙二醛（MDA）测定采用硫代巴比妥酸（TBA）反应法。
分别取胁迫和对照小麦叶片各0.3g，分别加石英砂和2mL0.05%磷酸缓冲液冰浴研磨再用2-3mL的磷酸缓冲液冲洗合并提取液，加5mL0.5%的硫代巴比妥酸摇匀，沸水浴10min（自试管内有气泡计时），然后冷水浴，4000r/min离心15min取上清液并量其体积，以0.5%硫代巴比妥酸为空白，测532nm、450nm处吸光度，计算含量的下图。
在20%的PEG6000胁迫下十一种小麦的MDA含量均有所上升，表明在模拟干旱胁迫下植物细胞膜都受到了伤害，只是程度有所不同，增加幅度就大的是商麦5226-8，从这个指标来看，其膜脂受伤害程度较大，而增加幅度较小的是832-9，植8788只有8%，同时增加较小的还有小偃22、绵阳19、新洛11。
表明其膜脂氧化产物较少，即在干旱胁迫下膜的受伤害程度较小。
2.4.2.8电导率的测定及分析
用电导仪测量正常生长小麦和胁迫生长小麦的电导率得下图：
植物在20%的PEG6000胁迫下原生质的结构会反生变化，原生质膜的选择透过性会减弱甚至丧失，对物质的透性当然也随之发生改变，有机物和盐类从细胞里边生出来，进入到外界环境。
通过电导率的测量，可以测出物质的外渗情况，表明植物的受伤害情况，间接反应了植物对外界不良环境的抗性。
如果植物在胁迫情况下比正常生长的电导率提高的比较小，说明植物细胞膜的受伤害程度比较小，也就是说植物抵抗外来侵害的能力比较强，即植物的抗性不好，反之则不好，分析可以看出商麦5226-1的伤害率最大，而绵阳19、832-9、商麦8928、小偃15、小偃22、新洛8号号、新洛11号、商麦9722的伤害率都比
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