AOAC_994.10(中文翻译).docx
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45.4.10
AOAC官方方法994.10
食品中的胆固醇
直接皂化——气相色谱法
1994年首次实施
（适用于每100克食品中含有≥1mg的胆固醇的测定）见表994.10，实验室研究的结果支持该方法的验收。
A.原理
试样的脂质在高温下经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化。
不皂化的部分含有胆固醇和其它甾醇用甲苯萃取。
甾醇衍生于三甲基甲硅烷（TMS）醚，然后用气相色谱仪进行定量。
B.仪器
（a）离心管——15mL，PyrexNo.13.硅烷化管如下：
用10％的氢氟酸装满管，静置10分钟。
先用水冲洗管，然后用无水甲醇冲洗。
在氮气流中干燥管。
在甲苯中，将管装满10％六甲基二硅烷（HMDS），静置1小时。
先用甲苯冲洗管，然后用无水甲醇
冲洗。
管在使用前放入100℃的烘箱干燥。
也可用商用silinizing试剂替代。
每次重复
使用前，都要用水，乙醇，己烷和丙酮清洗管，以及在100℃烘箱中干燥。
如果没有强碱清洗，管可以在重复使用而不需resilylation。
再次硅烷化管需至少6个月。
（b）气相色谱仪（GC）——FID检测器，毛细管柱，分流模式，25m×0.32mm×0.17m
膜厚度，交联5％苯基-甲基聚硅氧烷或甲基硅氧烷胶（例如，HewlettPackardNo.HP-5,Ultra2,或HP-1），在80-100网Supelco包装上拆分充满10%SP2100的衬管，和2斜坡烘箱温度编程（HewlettPackardModel5890A）。
操作条件：
温度——注射器250℃、检测器300℃、分析柱190℃，保持2分钟；增加20℃/分钟到230℃，保持3分钟；增加40℃/分钟到225℃，保持25分钟。
流速：
氦—柱约2毫升每分
钟，分流孔约30毫升每分钟，清洗孔约3毫升每分钟，辅助补充气约20毫升每分
钟；氢气—约35毫升每分钟；空气约280毫升每分钟。
（c）旋转式汽化器——浓度瓶和金属轴之间的玻璃冷凝器烧瓶。
（d）电磁搅拌器—电热板——有多种速度和热控。
（e）微量吸移管——能够吸移100和200L；金属材质
（f）试管混合器
（g）天平——分析天平，能准确称重至0.0001克
（h）玻璃器皿——锥形烧瓶，125毫升和250毫升；容量瓶和吸量管；量筒；分液漏斗，
500毫升。
C.试剂
（a）二甲基甲酰胺（DMF）——在玻璃中蒸馏。
（b）六甲基二硅烷（HMDS）
（c）5α-胆甾烷内标溶液——n-庚烷中0.1mg/mL。
标准5α-胆甾烷在SigmaChemicalCo.,
POBox14508,St.Louis,MO63278,USA有售。
（d）胆固醇标准品——
（1）贮备液——2.0mg/mL二甲基甲酰胺（DMF）。
（2）工作液—
—用DMF稀释贮备液得到6瓶浓度分别为0.0025、0.005、0.02、0.05、0.1、0.2mg/mL
的溶液。
（e）氢氧化钾溶液——
（1）50%氢氧化钾（w/w）——用约500克水溶解500克氢氧化钾。
（2）1M氢氧化钾——56克氢氧化钾溶解在约800毫升的水中，冷却和稀释到容量瓶1升的标记处（。
3）0.5M氢氧化钾——用一份水稀释一份1M氢氧化钾溶液。
（f）三甲基氯硅烷（TMCS）——No.88531，PierceChemicalCo.,或相等物。
（g）甲苯——在玻璃中蒸馏
（h）硫酸钠——无水
（i）玻璃纤维
D.皂化
称2-3g试样（W1），精确到0.001g，置入250mL锥形烧瓶。
试样的量应包含≤1g的脂肪或≤5g的水（例如，称1g纯净油，1.5g沙拉酱，和≤5g的高水分含量物质）。
将电磁搅拌器的搅拌棒放置烧瓶中。
向烧瓶加入40毫升95%乙醇和8毫升50%氢氧化钾溶液，C（e）
（1）。
（注：
部分乙醇可剩下留作加入氢氧化钾溶液之后的冲洗剂。
）
将烧瓶置于电磁搅拌器电热板，连接冷凝器，打开电热板，然后回流70±10分钟。
为确保完全皂化，边搅拌边检查是否有团块，若有则用玻璃棒搅散或添加氢氧化钾溶液。
关闭加热，在搅拌过程中，添加60mL的95%乙醇通过冷凝器。
（注意：
仔细添加，以避免酒精从冷凝器的顶部喷出。
）过了约15分钟后，将烧瓶移出冷凝器，塞上瓶塞，冷
却至室温。
测试溶液24小时内稳定。
E.提取
在搅拌过程中，向试样加入100mL的甲苯（V1）使试样皂化。
塞上瓶盖搅拌≥30秒。
将溶液倒进500mL分液漏斗，不需冲洗。
加110mL1M氢氧化钾溶液，C（e）
（2），剧烈摇晃漏斗10秒。
让其分层，弃去水层（低层）。
向分液漏斗中加入40mL0.5M的氢氧化钾溶液C（e）（3），倒转漏斗，将内容物轻柔打旋10秒。
弃去水层（低层）。
轻柔转动分液漏斗用40mL水洗涤甲苯层。
静置分层，弃去水层。
重复水洗至少3次，每次都需剧烈摇晃。
如果出现乳化作用，加入少量95%乙醇，打旋，使其分层，然后继续水洗。
洗至最后，甲苯层应为完全透明。
将甲苯层从分液漏斗的顶端倒入，流过放置有玻璃纤维和约20克硫酸钠的漏斗，最后流入内含2克硫酸钠的125mL的锥形烧瓶。
盖上瓶塞，摇动内容物。
让混合物放置15分钟以上。
如果密封的好，测试溶液也许可以保持不多于24小时。
用吸量管吸取25mL的提取液（V2）到125g平底长颈烧瓶，用旋转式汽化器以40±3℃蒸发干燥。
加入约3mL的丙酮，再次蒸发干燥。
将残留物溶解在3.0mL的DMF（V3），
C（a）。
最后DMF中的胆固醇的浓度应该在标准工作溶液的范围内，C（d）
（2）。
（注：
如果，
通过气相色谱仪定量后，试样的浓度超出标准曲线，则改变被蒸发的甲苯提取物的量或用于溶解残余物的DMF的量，或两者都改变，由此DMF中的胆固醇的最终浓度将落在标准范围内。
如果试样含有少量或者不含胆固醇，可用75毫升甲苯提取液干燥并再溶解在2mL的DMF中，以检测在1克试样中胆固醇浓度为1mg/100g。
）
F.衍生
用吸量管吸取1.0mL的等分标准工作溶液，C（d）
（2），和测试溶液，到两个15mL的离心管里，B（a）。
在每管中加入0.2mL的HMDS，C（b），和0.1mL的TMCS，C（f）。
用塞子密封离心管，放置试管混合器中或用手剧烈摇动30秒。
让溶液静置15分钟。
再往每个离心管中加入1.0mL的5α-胆甾烷内标溶液，C（c），和10mL的水。
用塞子密封离心管，剧烈摇动30秒，然后离心约2分钟。
将足够的庚烷（上部）层部分转移到注射小瓶中，确保没有水层转移。
衍生标准品和溶液必须在24小时内进行分析。
G.GC分析
注射1μL或其他合适的量进气相色谱仪。
用高宽测量或数为积分器测定5α-胆甾烷和胆固醇的峰面积。
（注：
5α-胆甾烷和胆固醇应分别洗脱11-13分钟和16-18分钟。
如果不能达到停留时间，调整载流和温度。
）
胆固醇峰面积除以内部标准峰面积就得到标准相应比率。
绘制4个高标准
（0.01-0.20mg/mL）对胆固醇浓度的响应比率。
标准响应比率图应包括测试溶液响应比率。
如有必要，为低等测试溶液绘制低标准曲线（0.0025-0.05mg/mL）。
稀释高等测试溶液使其落入标准范围。
计算衍生的g试样/mL：
W1为试样的重量，g；V1为提取时使用的甲苯的量，100mL；V2为干燥的等分提取液，
25mL；V3为用于溶解残留物的DMF的量，3mL。
计算试样中的胆固醇容量：
参考：
J.AOACInt.78,75（1995）.
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