如何理解测序蜂图Word文档格式.docx
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反应分别在4个试管中进行，每一试管中都含有：
1.待测的DNA单链片段，作为模板；
2.DNA聚合酶；
3.序列已知且与模板3'
端互补的引物；
4.四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP和dTTP）；
5.四种双脱氧核苷酸中的一种，作为DNA链合成的末端终止剂。
在适当条件下进行互补链的合成，由于新掺入的核苷酸只能同新生链3’端的-OH连接，而2’,3’-双脱氧核苷三磷酸核糖基的2’,3’位-OH的氧已脱掉，失去了和后来的核苷酸连接的可能性，这时碱基的掺入就有两种可能性：
1.dNTP掺入新生链，使链继续延伸。
2.2’,3’-ddNTP掺入，使新生链的合成终止。
由于两者掺入的几率不同，就形成一套长度不一的DNA片段。
最后通过A、T、G和C四组反应的凝胶电泳放射自显影图谱，即可读出所测样品互补链的核苷酸序列。
要求测序时使用的DNA聚合酶不能有5’-3’外切酶活性（可将新合成DNA链的5’-末端除去核苷酸而改变链的长度）、3’-5’外切酶活性（可将错配的碱基除去，再补上正确配对的核苷酸）。
这两种活性会产生干扰条带。
荧光染料标记物在Sanger法中的应用
目前已发现具有不同荧光色彩的标记化合物，可将其分别与指定的ddNTP结合，如ddATP标记绿色荧光，ddCTP蓝色荧光，ddTTP红色荧光，ddGTP黑色荧光。
这四种标记的ddNTP混合加入到一个反应中，聚合链终止反应完成后，可以获得末端分别带有A、C、T和G的DNA单链。
毛细管电泳
带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其分配系数不同进行高效、快速分离的电泳技术。
峰图是以4种颜色连续的峰型图代表A、T、G、C4种碱基序列的图。
峰的高低说明了信号的强弱，宽窄表示的是分离效果，可以对比板胶电泳的亮度和条带的宽窄。
重叠则说明了样品中有长度相同但是序列不同的片段。
概念：
读长：
序列读取的碱基长度，峰图上方横向显示的数字。
信号：
测序序列是通过对不同碱基所携带的不同颜色的荧光信号翻译所得，荧光信号的强弱是我们常说的信号。
成功峰图？
峰型：
尖锐、对称、无底峰；
读长：
800bp可信；
信号：
正常（1k~20k），走势平缓下降。
测序峰图中可能存在的问题
峰型问题
可信读长问题
信号问题
双峰
非单克隆
特征：
从插入位点开始双峰或某个位置开始双峰。
处理方法：
重新挑单克隆测序。
杂合（突变）
特征：
峰图中某些位置双峰。
Figure1SNP
Figure2杂合
缺失
从碱基缺失位置出现移码。
移码-----底峰序列表现为主峰向左或向右移动后的序列。
引物问题（YM）：
引物合成不纯或降解
序列一开始就出现移码现象
重新合成引物再测序
结合问题（JH）
（1）一开始就是双峰，在某一点终止或从头到尾双峰
可能原因：
模板上有2个或2个以上以上引物结合位点、模板或引物不纯。
重新制备样品或设计特异引物测序
夹峰：
模板量高
峰图中两峰之间夹有小杂峰，一般不影响主峰的读取，在信号图中表现为反应信号过高。
直接或稀释重跑，降低模板量测序
宽峰
模板不纯或POP7胶中有气泡
重跑
底峰不干净
信号图中基线不齐或信号弱
模板纯度不好，有杂质；
模板量偏低或反应进行不充分
处理办法：
重新纯化或重送样；
加量重做或重送样
引物峰及引物二聚体峰
在20-30、40-60bp碱基处有高信号的峰形成，之后信号可能衰减。
重新合成引物或重新设计引物测序。
引物形成二聚体致使反应无信号
干扰峰（染料峰）和酒精峰
4个干扰峰固定出现在30、40、70、110bp附近。
重新测序
降解峰
在220、450bp附近G碱基降解，峰型扩散。
若不影响碱基判读不安排调整，否则安排重新测序。
重复序列（CF）
单碱基或两个以上碱基重复出现，导致后续峰图可能移码或乱峰。
因重复未测到的序列，建议加测反向补拼。
高GC（GC）
序列局部碱基GC富集，之后可能信号衰减，峰图变乱。
回文结构及其他结构（JG）
信号衰减或中断，峰图变乱。
最好选用GC优化程序。
无信号
峰图表现为杂乱无章。
形成原因：
引物和模板不能正常结合反应，包括漏加，加错，有影响结合或影响反应因素。
菌液用通用引物测无信号的安排重新摇菌、自带引物无信号建议通用引物测序；
质粒、pcr测序无信号的不调整，建议客户重新送样，若失败较多的挑几个重测，并跟客户说明情况
在进行DNA测序时，紧接引物的10~30碱基有时不一定能完全读清楚。
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