专题二十基因工程Word文件下载.docx

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比较项目

限制酶

DNA连接酶

DNA聚合酶

解旋酶

作用底物

DNA分子

DNA分子片段

脱氧核苷酸

作用部位

磷酸二酯键

碱基对间的氢键

形成产物

黏性末端或平末端

形成重组DNA分子

新的DNA分子

形成单链DNA

2.限制酶

（1）识别序列的特点：

呈现碱基互补对称。

无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如

，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；

以

为轴，两侧碱基互补对称。

（2）切割后末端的种类

（3）限制酶的选择技巧

①根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类

a．应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

b．不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

c．为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。

②根据质粒的特点确定限制酶的种类

a．所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。

b．质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；

如果所选酶的切割位点不只一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

3．限制酶和DNA连接酶的关系

（1）限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。

（2）限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

（3）DNA连接酶起作用时，不需要模板。

4．载体

（1）条件与目的

条件

目的

稳定并能复制

目的基因稳定存在且数量可扩大

有一个至多个限制酶切割位点

可携带多个或多种外源基因

具有特殊的标记基因

便于重组DNA的鉴定和选择

（2）作用

①作为运载工具，将目的基因导入宿主细胞内。

②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

关于基因工程工具的几个易错点

（1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。

（2）限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。

（3）在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端或平末端。

（4）将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。

（5）不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。

（6）基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。

基因工程的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；

膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。

（7）基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。

例：

2016·

山东烟台市高三统考）图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。

现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。

请回答下列问题：

（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由__________________连接。

（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中的DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为________________________________。

（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。

从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。

（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。

在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。

经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是__________________________________________

________________________________________________________________________。

答案：

（1）脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖　

（2）平　537bp、790bp、661bp　（3）4　（4）BamHⅠ　抗生素B　同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接

（二）、基因工程的一般过程与技术

1．目的基因的获取

（1）直接分离法

（2）人工合成法

2．基因表达载体的构建

（1）基因表达载体的组成及作用

（2）基因表达载体的构建过程

3．将目的基因导入受体细胞

生物种类

植物

动物

微生物

常用方法

农杆菌转化法

显微注射技术

感受态细胞法

受体细胞

体细胞

受精卵

原核细胞

转化过程

将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达

将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物

Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

4.目的基因的检测与鉴定

补充：

聚合酶链式反应技术（PCR技术）

（1）PCR：

即聚合酶链式反应

（2）PCR技术：

在体外通过酶促反应有选择地大量扩增目的基因或序列的技术。

（3）方法：

5、基因表达载体的构建（核心）

（1）目的：

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因可以能够表达和发挥作用。

（2）组成：

目的基因+启动子+终止子+标记基因

RNA聚合酶识别和结合部位，位于基因的首端。

终止信号，位于基因的尾端。

鉴别受体细胞中是否含有目的基因。

（3）构建步骤：

用切割目的基因和载体，从而产生的黏性末端，再用

连接。

（形成的分子称：

重组DNA分子或重组质粒。

）

【特别提示】

插入的目的基因只是目的基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒前需有启动子，后需有终止子。

6、将目的基因导入受体细胞（转化）

（1）受体种类不同，导入方法不同

导入植物细胞：

农杆菌转化法（常用）、基因枪法、花粉管通道法。

导入动物细胞：

显微注射法。

导入微生物细胞：

Ca2+处理法。

（2）受体细胞的种类

植物：

可以是受精卵、体细胞（可经组织培养成完整个体）

动物：

受精卵（因为动物细胞的全能性受到抑制）

（3）转化实质：

目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。

基因工程操作过程中的几个易错点

（1）目的基因的插入位点不是随意的：

基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。

（2）基因工程操作过程中只有第三步（将目的基因导入受体细胞）没有碱基互补配对现象：

第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测分子水平杂交。

（3）农杆菌转化法原理：

农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。

（4）目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。

转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。

（5）标记基因的种类和作用：

标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因（表达产物为带颜色的物质）等。

（6）受体细胞的选择：

受体细胞常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物（大肠杆菌、酵母菌）等。

要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌（需内质网、高尔基体的加工、分泌）；

一般不用支原体，原因是它营寄生生活；

一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，也没有核糖体等细胞器，不能合成蛋白质。

（7）还应注意的问题有：

①基因表达载体中，启动子（DNA片段）≠起始密码子（RNA）；

终止子（DNA片段）≠终止密码子（RNA）。

②基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。

（2015·

高考四川卷，9，11分）将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示（注：

农杆菌中Ti质粒上只有TDNA片段能转移到植物细胞中）。

（1）过程①需用同种________________酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。

为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用________培养基。

（2）过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让________进入棉花细胞；

除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是___________________

（3）若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加________________以获得芽；

部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是_______________________________________。

（4）检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是________。

种植转基因抗虫棉能减少________的使用，以减轻环境污染。

（1）限制性核酸内切　选择　

（2）TDNA　筛选获得TDNA片段的植物细胞　（3）细胞分裂素浓度　芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化　（4）投放棉铃虫　农药

2．（2014·

高考山东卷，36，改编，12分）人组织纤溶酶原激活物（htPA）是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。

流程如下：

（1）htPA基因与载体用____________________________切割后，通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。

检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用__________________技术。

（2）将重组表达载体导入受精卵常用的方法是________。

为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行________。

利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的________。

（3）若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到________，说明目的基因成功表达。

（1）同种限制性核酸内切酶（或同种限制酶）　DNA分子杂交（或核酸探针）　

（2）显微注射法　性别鉴定　全能性

（3）htPA（或人组织纤溶酶原激活物）

二、基因工程应用和发展

1、方法：

提取目的基因→装入载体→导入受体细胞→基因表达→筛选出符合要求的新品种

2、原理：

基因重组。

3、优点：

目的性强，可以按照人们的意愿定向改造生物；

育种周期短。

4、缺点：

技术复杂，存在安全性问题。

5、实例：

抗软化番茄的培育。

思考：

（1）基因工程的物质基础是：

所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。

（2）基因工程的结构基础是：

所有生物的DNA均为双螺旋结构。

（3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为

应用方向：

基因治疗与基因诊断的不同点

原理

操作过程

进展

基因

治疗

基因表达

利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗（疾病）

临床

实验

诊断

碱基互补

配对

制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况

应用

2.蛋白质工程

（1）流程图：

写出流程图中字母代表的含义：

A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。

（2）结果：

改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。

（3）应用：

主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。

蛋白质工程与基因工程的比较

（1）区别

项目

蛋白质工程

基因工程

过程

预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列

获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定

实质

定向改造或生产人类所需的蛋白质

定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品

结果

可生产自然界没有的蛋白质

只能生产自然界已有的蛋白质

（2）联系

①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。

②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。

1、（2014·

新课标Ⅱ，40）植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。

若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。

回答下列问题：

（1）理论上，基因组文库含有生物的____________基因；

而cDNA文库中含有生物的________基因。

（2）若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中________出所需的耐旱基因。

（3）将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物________的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。

要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的____________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的__________是否得到提高。

（4）假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了________________________（填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”）。

答案　

（1）全部　部分　

（2）筛选　（3）乙　表达产物　耐旱性　（4）同源染色体的一条上

2、（2015·

高考全国卷Ⅱ，40，15分）已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。

如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。

（1）从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。

（2）以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________________基因。

所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：

（3）蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________________和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。

（1）氨基酸序列（或结构）（其他合理答案也可）

（2）P　P1　DNA和RNA（或遗传物质）　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质（或转录、逆转录、翻译）

（3）设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能