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TerminaliachebulaRetz或绒毛诃子TchebulmRetzvartomentellaKurt的干燥成熟果
实，生产于印度及斯里兰卡，我国云南亦有生产。
诃子具有涩肠止泻敛肺，降火利咽
的功效。
诃子的主成分为诃子酸（chebulinicacid）、诃黎勒酸（chebulagicacid）、1,3,6-三
没食子酰葡萄糖等[2]。
近期报道有三帖类、多元酚酸类、脂肪族化合物以及氨基酸、
矿物质等成分[3]。
对诃子药理作用研究发现诃子具有抗菌、强心、抗氧化以及解痉等
作用[4]，另有文献报道含有诃子的复方具有明显的抗肿瘤及抗艾滋病毒活性[5，6]。
关于诃子保肝作用的研究，本研究室在先前的动物实验中已有报道[7]。
本文采用体外
分离大鼠肝细胞进行肝细胞原代培养，用CCl4诱导肝细胞损伤模型，观察诃子提取物
（extractofTerminaliachebulaRetz，ET）对肝细胞损伤保护作用以及作用机理的初步研
究，并为进一步发现活性组分确定体外筛选技术。
1材料与仪器
1.1药物诃子购自内蒙古凯蒙大药房，经内蒙古医学院药学院植化教研室庞秀生教授
鉴定为使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz的干燥成熟果实。
2
1.2试剂MTT、Ⅳ型胶原酶购自SIGMA公司，RPMI-1640购自GIBCO公司，CCl4
天津市化学试剂三厂生产，GOT购自中生北控生物科技股份有限公司，MDA、SOD、
GSH-Px试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
其它试剂均为市售分析纯。
1.3动物清洁级Wistar大鼠，体质量（20020）g，购自内蒙古大学实验动物中心（动物
号YXQ（蒙）2002-0001）。
1.4仪器SCOTT-Ⅱ半自动生化分析仪（意大利MENARINI公司），721型紫外分光光
度计（上海第三分析仪器厂），高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机厂），MODEL680型酶联
免疫检测仪（Bio-BadLABORATIES,INC）。
2方法
2.1诃子提取物的制备100g鞣质经3次丙酮提取后（55℃加热回流提取），弃去残
渣，收集合并3次滤液，加入等体积的乙醚除杂质，弃去醚层，收集水层，用等体积
的醋酸乙酯萃取5~6次，收集醋酸乙酯层，回收醋酸乙酯，在55℃水浴蒸干得黄色粉
末，研磨备用。
3
2.2诃子含药血清制备大鼠实验前禁食12h，大鼠20只分为5组，雌雄各半，实验
前禁食12h。
空白组每天灌服蒸馏水（2m1/kg）、诃子含药血清4个不同给药组（剂量分
别为0.06，0.3，0.6，0.9g/kg）,各组每天给药2次，连续灌服3d并在最后1次灌胃后2
h,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，行腹主动脉无菌采血凝固后，低温离心分离血清，将各组
4只大鼠血清混合，置-20℃冰箱保存备用[8]。
2.3大鼠肝实质细胞原代培养取Wistar大鼠1只、体质量（20020）g雌雄不限、先腹
腔注射4%戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，皮毛消毒后，背位固定在解剖板上，在无菌条件
下打开腹腔分离肝脏，找到门静脉和下腔静脉并尽量与周围组织剥离干净，在门静脉
近心、远心端以及下腔静脉各穿一根灭菌手术线后，结扎门静脉远心端和下腔静脉手
术线，做门静脉插管。
先以37℃的灌流液以蠕动泵恒速在位灌流，待肝脏肿胀变大
后，迅速剪断下腔静脉结扎线的远心端以使灌流液顺畅流出，待预灌流液结束后,更换
为Ⅳ型胶原酶灌流液，继续做在位灌流，灌流结束后剪断肝脏与周围组织的连接，将
肝脏移至玻璃平皿中用不完全1640培养液清洗，之后小心撕开肝脏包膜轻轻振摇抖落
肝细胞成肝细胞悬液。
收集悬液于锥形瓶中，37℃振荡培养15min，培养结束后立即
置冰水中冷却，100目不锈钢钢网过滤，收集滤液在4℃条件下800r/min离心3min，
弃上清，用清洗液按照上述条件清洗离心3次，末次弃上清后，以培养液重悬制成1
106个/ml肝细胞悬液，用台盼蓝染色，当肝细胞活力大于85%时用于实验[9]。
2.4CCl4致肝细胞损伤模型的建立肝细胞培养36h后，更换培养液并加入CCl4（终浓
度为20mmol/L）以少量的DMSO助溶，继续培养1h。
4
2.5MTT法检测诃子提取物及含药血清对CCl4诱导肝细胞损伤保护作用取贴壁生长
的肝细胞，设空白组、CCl4模型组、诃子提取均设置4个剂量组（0.4，0.6，0.8，
1mg/L）;
另外设置4个诃子提取物含药血清组，使血清终体积为20%，每组设8个复
孔。
各组在加入CCl4培养1h后，分别加入待测药物继续培养6h，在光镜下进行细胞
形态学检查，同时每孔加MTT10l，孵育4h，弃去上清，每孔加DMSO150l，振摇
10min，在570nm处用酶标仪检测吸光度。
2.6GOT、MDA、SOD和GSH-Px的检测收集各孔中的细胞，参照试剂盒说明书检
测GOT、SOD和GSH-Px以及MDA含量。
tips:
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仅供参阅！
海杧果茎的挥发性成分的研究
5
李海燕，王茂媛，邓必玉，王建荣，晏小霞，王祝年
【摘要】目的对海杧果茎的挥发性成分进行研究。
方法用95%乙醇冷浸，减压回
收乙醇，继用石油醚萃取，得到石油醚萃取物。
将石油醚萃取物用GC-MS进行分离测
定，结合计算机检索技术对分离的化合物进行结构鉴定，应用色谱峰面积归一化法计
算各化合物的相对百分含量。
结果海杧果茎的石油醚萃取物中检出44个色谱峰，鉴
定出28个化合物，占挥发性成分总量的63.900%。
结论海杧果茎的挥发性成分以脂
肪酸、烯醇、烯酸类、甾醇类和烷烃类为主，主要脂肪酸有棕榈酸、硬脂酸、油酸、
亚油酸等。
【关键词】海杧果;
气相色谱-质谱联用;
挥发性成分
海杧果CerberamanghasLinnaeus又称海芒果，别名山样子、猴欢喜（台湾）、黄金茄
（琼海）、牛金茄、牛心荔、黄金调（文昌），为夹竹桃科（Apocynaceae）海杧果属（Cerbera
Linnaeus）植物。
海杧果属植物约9种，我国产1种[1]，即海杧果C.manghas,分布于广
东和台湾。
本种的果实有剧毒，以核仁最毒，含毒成分为氢氰酸和海杧果苷
（Cerberin），误食足以致死。
树皮、叶、乳汁药用，有催吐、下泻之效，但用量需慎重
[2];
一般入外科膏药、麻药用;
可主治心力衰竭的急性病[3]。
国内外对海杧果化学成分和药理活性的研究较多也比较深入，但未见对其挥发性成
6
分的报道。
为此，笔者采用GC-MS联用仪分析了海杧果茎的石油醚萃取物的挥发性成
分。
现报道如下。
1材料
海杧果的茎采于海南省文昌市龙楼镇，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研
究所王祝年研究员鉴定。
美国惠普公司（HewlettPackard）HP26890/HP5973GC-MS气质
联用仪。
其它试剂均为国产分析纯试剂。
将海杧果的茎晒干粉碎，用95%（体积分数）乙醇冷浸，减压回收乙醇，得到海杧果茎
的乙醇粗提物，将海杧果茎的乙醇粗提物加水悬浮，用石油醚萃取，减压回收石油
醚，取该提取物（油状）10ml作为供试品。
取该提取物10l进样。
用GC/MS仪器分别进行分离测定。
2.1气相色谱条件SE230弹性石英毛细管柱为HP-5MS5%PhenylMethylSiloxane
（30mm0.25mm0.25mm），柱温50℃（保留2min），以5℃min-1升温至300℃，保持
7
15min;
汽化室温度250℃;
载气为99.999%的氦气;
柱前压为52.5018kPa，载气流量1.0
mlmin-1;
进样量1分流比20：
1。
2.2质谱条件离子源为EI源;
离子源温度230℃;
四极杆温度150℃;
电子能量70eV;
发
射电流34.6A;
倍增器电压1071V;
接口温度280℃;
质量范围10～550amu。
2.3定性分析通过HPMSD化学工作站，结合Nist05质谱图库和Wiley275质谱图
库，同时结合有关质谱图文献解析，以此鉴定海杧果茎样品中的挥发性物质的化学成
2.4定量分析通过HPMSD化学工作站数据处理系统，按峰面积归一化法计算出各化
学成分在挥发性成分中的峰面积相对百分含量。
3结果
从海杧果茎的石油醚萃取物中检出44个色谱峰，鉴定出28个化合物，占挥发性成
分总量的63.900%。
结果见表1和图1表1海杧果茎的石油醚萃取物检出化学成分及
峰面积相对含量甾烷-3,6-二酮C29H48O24280.660合计：
63.9001海杧果茎的石油醚萃
取物的总离子流程图
8
4结论
海杧果茎的石油醚萃取物中检出44个色谱峰，鉴定出28个化合物，占挥发性成分
总量的63.900%。
海杧果茎的挥发性成分以脂肪酸、烯醇、烯酸类、甾醇类和烷烃类
为主，主要脂肪酸有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等。
本实验为海杧果的深层次开
发利用提供了参考依据。
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中国医药科技出版社，2001：
505.
医药卫生栏目
9
3.1光镜下观察诃子提取物对于CCl4所诱导损失的保护作用在光镜下观察发现CCl4
损伤1h后，肝细胞形态发生显著的变化，镜下可以看到细胞的膜结构被破坏，大量肿
胀坏死细胞。
而诃子提取物以及含药血清组中对于这种形态改变具有显著的改善作
用。
3.2诃子提取物以及含药血清对CCl4诱导肝细胞损伤后细胞活力的影响诃子提取各
浓度组（0.4，0.6，0.8，1mg/L）分别作用于肝细胞损伤6h后，由MTT结果可以看出，
诃子提取物0.6，0.8，1mg/L组中与CCl4模型组比较具有明显的保护作用（P0.01），而
且这种保护作用具有一定的量效关系。
见表1将不同剂量制备的诃子含药血清与肝细
胞作用6h后，对于CCl4所致的肝损伤具有一定保护作用，在各剂量组中只有在0.9
g/kg具有显著的保肝作用（P0.05），其他各剂量组的肝脏保护作用并不显著，结果见表
3.3诃子提取物以及含药血清对GOT的影响诃子提取物对于CCl4所致的GOT渗出
10
率有很好的抑制作用，可以显著降低GOT的活性，在0.6,0.8,1mg/L剂量时对CCl4引
起的肝细胞损伤具有显著的保护作用（P0.05或P0.01）。
结果见表2。
在诃子含药血清
各组别中，0.9g/kg时具有显著的作用，显著降低GOT的渗出（P0.05）。
结果见表2表
1诃子提取物及含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤MTT的结果表2诃子提取物及
含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤GOT的影响
3.4诃子提取物及含药血清对肝细胞MDA的影响CCl4损伤后可以导致显著的脂质
过氧化反应，使脂质过氧化产物MDA显著升高，诃子提取物在0.6，0.8，1mg/L时能
够显著抑制CCl4所致的MDA升高（P0.05或P0.01），具有显著的抑制脂质过氧化作
见表3诃子含药血清对于异常升高的MDA具有显著的抑制作用，在剂量组0.6，
0.9g/kg时均具有显著的作用（P0.05）。
见表3。
3.5诃子提取物及含药血清对SOD及GSH-Px的影响SOD和GSH-Px是体内重要的
抗脂质过氧化酶类，诃子提取物0.6，0.8，1mg/L能够显著的提高SOD的活性（P0.05
或0.01），并具有一定的量效关系。
对于GSH-Px的活性影响不显著，诃子提取物仅在
1mg/L时能够显著的提高GSH-Px酶活性（P0.05），而在0.4mg/L时具有显著的降低
GSH-Px活性的作用（P0.01），可能实验误差等原因所致。
见表4。
表3诃子提取物及
含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤MDA的影响表4诃子提取物对CCl4所致大鼠
肝细胞损伤SOD、GSH-Px的影响诃子提取物含药血清在0.3，0.6，0.9g/kg时能够显
著的提高SOD的活性（P0.05或P0.01），同时具有一定的量效关系。
诃子提取物含药血
清对于GSH-Px活性的影响，在0.6g/L和0.9g/L均可以显著的提高GSH-Px酶活性（P
0.05），而0.06g/L时则显著的降低酶活性，可能与实验误差有关。
结果见表5。
11
4讨论
诃子是在中蒙药中经常使用的一味药，具有多方面的药理作用。
实验中采用CCl4诱
导肝细胞损伤的方法，CCl4是经典的致急性肝中毒试剂。
目前，一致认为自由基的形
成及引发的链式过氧化反应是其中毒作用的主要机制。
CCl4在肝细胞内，在细胞色素
P-450作用下，产生O2-、CCl3-、CCl3OO-、OH等自由基和H2O2，诱导细
胞膜发生脂质过氧化反应，并引发一连串的自由基链反应，从而破坏生物膜结构的完
整性，引起膜通透性增高，导致胞内相关酶外释，细胞内氧化还原的平衡状态被打
破，最终导致细胞死亡[10]。
实验中通过镜检以及MTT法发现诃子提取物以及含药血
清对于CCl4诱导的细胞的死亡具有很好的抑制作用，能显著的提高细胞活力。
表5
诃子提取物含药血清对CCl4所致大鼠肝细胞损伤SOD、GSH-Px的影响MDA是细
胞膜脂质过氧化反应的终产物，细胞中MDA含量多少可反映细胞脂质过氧化损伤程
度;
SOD和GSH是细胞内源性重要的抗氧化剂，其含量多少是衡量细胞抗氧化能力大
小的重要指标。
因此，MDA生成量与SOD和GSH含量水平两个指标可直接反映细
胞脂质过氧化反应程度。
在诃子提取物及含药血清均可以降低MDA的含量并提高
SOD和GSH的活性，以上均提示了诃子的保肝作用与抗脂质过氧化作用有关。
总之，我们通过体外实验发现诃子的保肝作用与提高抗脂质过氧化作用有关，血清
药理学被用于诃子保肝作用的研究中。
但是，通过对比发现，可能由于诃子保肝有效
成分含量低或在体内生物利用度比较低，导致了诃子提取物含药血清保肝作用并不是
很理想。
而这些正是下一阶段研究方向，通过本实验中建立成熟的体外肝细胞损伤模
型，为筛选诃子保肝作用活性单体并完善相应分子机理奠定基础。
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